IL-15和树突状细胞诱导CD4CD25调节性T细胞增殖的实验研究

摘要

目前,临床器官移植取得了显著的进步,器官移植后短期(1年)存活率达到90％以上;但是,长期存活率仍不理想。其原因主要是由于慢性排斥反应以及非特异性的免疫抑制药物的毒副作用引起。如何让器官移植受者在不使用或少使用免疫抑制药物的前提下,对移植器官不产生免疫识别和/或免疫攻击,也就是特异性针对移植器官免疫耐受,是目前移植医学难题之一。在移植免疫耐受机制的研究中,CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)的作用越来越受到大家的重视。Tregs是一类高表达CD25和叉头/翼形螺旋状转录因子(Foxp3)的CD4+T细胞,具有很强的免疫抑制功能。研究表明,输注Tregs可控制移植物抗宿主病和移植排斥反应的发生。然而,体内天然产生的Tregs在正常生理状态下,仅占外周血单个核细胞数量的1％,与效应T细胞不同,它们被T细胞表面受体(TCR)激活后仍保持无能状态,极低增殖;而且目前尚无有效的手段诱导体内。Tregs大量扩增。显然,为了达到治疗目的,必须在体外大量扩增Tregs再输回患者体内。如何扩增Tregs以用于诱导器官移植免疫耐受,是目前移植医学研究的热点问题之一。
　　 白介素15(IL-15)是1994年由Burton和Grabstein同时发现的一种细胞因子。由于IL-15与IL-2结构中均含4α螺旋结构,IL-15与IL-2一起共享IL-2受体β和γ链(IL-2Rβγ/γc),有学者将IL-15归类于IL-2细胞因子家族,二者对T细胞作用后的许多效应有相同之处。不同在于IL-15主要以与IL-15Rα链高亲和力结合状态存在,即使缺乏IL-2Rβ和IL-2Rγ/γc受体亚单位,IL-15与其受体α私有链仍有着高度的亲和力(Ka≥1011M-1);而在缺乏IL-2Rβγ时,IL-2与IL-2Rα的亲和力却很低(Ka～108M-1)。体外实验表明,IL-2扩增Tregs的能力优于IL-15,然而IL-2或者IL-15缺陷小鼠体内Tregs数量和功能轻度下降或正常,只有当二者均缺陷时才会出现Tregs数量和功能显著下降。表明IL-15在Tregs的扩增中同样发挥重要作用,但IL-15是如何发挥作用还有待于进一步研究。
　　 Rachael等将IL-15、表皮成纤维细胞各自单独与Tregs培养时不能增殖Tregs,但将二者联合后却能显著增殖Tregs,提示IL-15在其他细胞存在的条件下才能发挥增殖Tregs的作用。既往研究表明IL-15联合表皮成纤维细胞促进活化的T细胞增殖时主要是由表皮成纤维细胞以膜结合的形式向T细胞递呈IL-15。在免疫反应的启动中,树突状细胞(DC)是功能最强的激活初始T细胞的抗原递呈细胞,与表皮成纤维细胞一样,DC也能以膜结合的形式向靶细胞递呈IL-15。DC是否同样可以以膜结合的形式向Tregs细胞递呈IL-15而诱导Tregs增殖尚不清楚。因此,本研究从人外周血中分离出Tregs,随后将IL-15、DC单独或联合干预Tregs的生长,从分子水平探讨IL-15和DC对Tregs的作用及机制,为体外更好地扩增Tregs以得到足够数量的Tregs用于诱导器官移植免疫耐受奠定实验基础。
　　 我们将本研究主要方法、获得的主要结果和结论归纳如下:
　　 一、树突状细胞与CD4+CD25+调节性T细胞的分离及鉴定。
　　 1.人外周血贴壁的单核细胞经GM-CSF+IL-4联合诱导,于第6天负载同种异体抗原,培养第7天收集获得的细胞,光镜、电镜观察细胞的形态;流式细胞仪检测细胞表面标志物;将所得细胞经丝裂霉素灭活后与自体CD4+CD25-T细胞混合淋巴细胞培养72h,3H-TdR掺入法检测CD4+CD25-T细胞的增殖。结果显示,所得细胞逐渐由贴壁变成悬浮,细胞形态不规则,表面粗糙,有大量层叠状皱襞和毛刺状突起,表达共刺激分子CD80、CD86,MLR显示能刺激自体CD4+CD25-T细胞增殖。表明所得细胞具有DC的细胞形态、免疫表型及功能特性,说明实验中建立的分离培养DC的方法是可行的。
　　 2.人外周血单个核细胞经免疫磁珠阴性分选和阳性分选,将获得的细胞经台盼蓝染色检测细胞的活力;流式细胞仪检测细胞的纯度和细胞表型;将所得细胞经丝裂霉素灭活后与自体CD4+CD25-T细胞混合淋巴细胞培养,包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠刺激72h,3H-TdR掺入法检测CD4+CD25-T细胞的增殖。结果显示所得细胞活力为(95.7±2.1)％,纯度为95.2％,胞内因子Foxp3在Tregs细胞的表达率为94.2％,在体外能抑制致敏T淋巴细胞增殖。表明所得细胞具有Tregs的细胞表型及功能特性,说明本实验建立的方法可以在体外分离出Tregs,为进一步研究Tregs打下基础。
　　 二、IL-15和树突状细胞诱导增殖后CD4+CD25+调节性T细胞的表型与功能
　　 1.Tregs按1×104/孔置于U型底96孔板中,依据每孔加入的DC(1×104/孔,经丝裂霉素灭活)或包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠(1×104磁珠/孔)不同分为四大组:负载同种异体抗原的DC+IL-2组(简称DC+IL-2组)、负载同种异体抗原的DC+IL-15组(简称Dc+IL-15组)、包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠+IL-2组(简称CD3/CD28+IL-2组)和包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠+IL-15组(简称CD3/CD28+IL-15组),各组内依据细胞因子浓度不同分为0、25U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml等小组,各小组3复孔。培养第5天,3H-TdR掺入法检测Tregs增殖。结果显示在包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠刺激下,IL-15在0---100U/ml的浓度范围内,基本不引起Tregs增殖,至200U/ml浓度时,可引起Tregs轻度增殖;而在包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠刺激下,IL-2在25U/ml浓度时即可引起Tregs显著性增殖(较同等浓度的IL-15);在负载同种异体抗原的DC刺激下,IL-15和IL-2一样,在0---200U/ml的浓度范围内,成剂量依赖性诱导Tregs增殖,且在100U/ml和200U/ml浓度时,二者诱导Tregs增殖的幅度无显著性差异。说明在DC存在的情况下,IL-15也能诱导Tregs增殖。
　　 2.从培养体系中免疫磁珠阳性分选出CD4+T细胞,流式细胞仪检测该细胞的纯度、细胞表型和CD62L;3H-TdR掺入法检测该细胞对CD4+CD25-T细胞的增殖的抑制作用。结果显示,DC跨细胞递呈IL-15增殖的Tregs纯度高,仍具有典型的CD4+CD25+Foxp3+表型特征,在体外对特异性同种异体抗原激活的Teff增殖的抑制功能强,对第三方同种异体抗原激活的Teff的免疫抑制功能弱,且Tregs高表达CD62L。说明DC跨细胞递呈IL-15增殖的Tregs具有天然Tegs的细胞表型,具有的特异性抑制作用,具备到达特定的作用部位发挥作用的能力。
　　 三、IL-15和树突状细胞诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖的作用机制
　　 结论
　　 一、成功建立了从人外周血分离培养DC和Tregs的方法。
　　 二、在DC存在的情况下,IL-15也能大量诱导Tregs增殖。DC和IL-15诱导增殖的Tegs纯度高,具有天然Tegs的细胞表型,具有特异性抑制作用,具备到达特定的作用部位发挥作用的能力,有用于临床诱导移植免疫耐受的潜力。
　　 三、DC和IL-15诱导Tregs增殖的作用形式主要是通过由DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。IL-15还可在DC跨胞内体再循环,从而使IL-15持续长时间存在于DC细胞表面,继续通过DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。此外,IL-15调节DC分泌IL-2可能在DC和IL-15诱导Tregs增殖的过程中起辅助作用。
　　 四、DC和IL-15诱导Tregs增殖,其分子机制可能是通过Tregs的Akt、Erk1/2和STAT5的活化以及p27kiP1的降解。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写简表

前言

第一部分 树突状细胞与CD4+CD25+调节性T细胞的分离及鉴定

第一节 单核细胞来源的树突状细胞的诱导、抗原负载与鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二节 CD4+CD25+调节性T细胞的分离与鉴定

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 IL-15和树突状细胞诱导增殖后CD4+CD25+调节性T细胞的表型与功能

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 IL-15和树突状细胞诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖的作用机制

第一节 IL-15和树突状细胞诱导CD4+CD25+调节T细胞增殖的作用形式

材料与方法

结果

讨论

第二节 IL-15和树突状细胞诱导CD4+CD25+调节T细胞增殖的分子机制

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

致谢

参考文献

文献综述一 IL-15作用机制研究进展

文献综述二 CD4+CD25+调节性T细胞增殖研究进展

攻读博士学位期间发表论文情况