果蔬用直投式发酵剂的研制与应用

摘要

传统的果蔬发酵方法所存在的问题有发酵时间长，发酵产品容易被污染，发酵产品品质不能统一。采用直投式发酵剂发酵的果蔬不仅大大的缩短了发酵时间，所得到的品质也能相对统一，菌体的储存、使用也极为方便。所以我们对尚处在研究阶段的直投式发酵剂的各个生产阶段进行优化，包括菌体增殖条件，冻干保护剂的最优组合，还对经直投式发酵剂发酵的果蔬与采用传统发酵方法发酵的果蔬进行对比，主要从挥发性气味与感官评定两方面考虑，最后为了更微观更直观的考察保护剂对菌体的保护。本项研究对果蔬直投式发酵剂的工业化生产提供了试验数据，对果蔬发酵产业的技术提高具有重要的理论和经济价。本文主要研究结果如下：
　　 1、高浓缩菌体的研制
　　 经过在几种经典培养基中的比较研究，培养得出天然的培养基物质对菌体的增菌效果明显，而盐离子对菌体的促进作用不大。再进一步对培养基优化过程中选取了几种天然的增殖因子对菌体进行单因素优化试验研究，得到促进效果明显的因子为：L.p为麦芽浸粉、水解大豆蛋白胨、番茄汁；L.m为蔗糖、酵母粉、麦芽汁。
　　 运用数学统计软件Design Expert7.0的分析，我们得到了L.p培养条件的回归方程为：
　　 (1)Lp活菌数=25.04+0.69A+4.82B+2.64C+3.01AB+0.82AC+3.19BC-2.84A2-4.09B2-3.29C2
　　 由分析得出：当麦芽浸粉含量为1.61g/100mL，水解大豆蛋白胨取1.47g/100mL，与番茄汁7.36mL/mL时活菌数可达到最大值30.125×109 cfu/mL。
　　 (2)L.m活菌数=8.35-1.38A-0.21B-1.06C+1.01AB+1.12AC+0.34BC-1.12A2-0.9882-1.39C2
　　 由方程可以得出：当蔗糖取1.04g/100mL酵母粉含量取0.41g/100mL麦芽汁添加量为4.58mL/100mL时活菌数可达到11.7×109 cfu/mL。
　　 即L.p的最佳培养基为：麦芽浸粉1.61g/100mL、水解大豆蛋白胨取1.47g/100mL、与番茄汁7.36mL/mL、02％KH2PO4、0.02％NaHPO4。
　　 L.m的最佳培养基为：蔗糖1.04g/100mL、酵母粉0.41g/100mL、麦芽汁添4.58mL/100mL、0.02％KH2PO4、0.02％NaHPO4。
　　 在对L.p与L.m的生长条件进行优化时，我们得到L.p的最适生长温度为30℃，L.m的最适生长温度为35℃，L.m最适培养的pH值为7，而L.p最佳培养pH值为6，最佳的收集时间均为18h。
　　 在对离心条件进行优化时，得到结果8000rpm，4℃，10min。
　　 2、L.p与.L.m冷冻干燥保护剂的优化研究
　　 将离心后的菌泥加入含不同保护剂的12％的脱脂乳，通过单因素实验的结果选取4种保护剂做响应面分析，得到优化后的冻干保护剂配方。
　　 运用数学统计软件Design Expert7.0的分析，我们用响应面的方法对冻干保护剂的最优组合进行了实验，结果表明
　　 (1)L.p的回归方程：L.p的存活率=91.26+7.15A+7.30B+5.83C+2.93D+2.86A B+1.41AC+2.705AD+1.55BC+6.66BD-0.89CD-16.26A2-14.09B2-8.23C2-5.89D2
　　 由此得出：当海藻糖添加量6％，侧金盏花醇3.89％，谷氨酸钠3.79％，乳清4.09％时，L.p的此存活率可以达到95.96％。做三次验证试验平均存活率在93.51％与预测结果接近，
　　 (2)L.m的回归方程为：L.m的存活率
　　 =89.81+5.61A+7.67B+5.37C+5.13D+0.25AB+1.36AC+1.42AD+1.49BC+4.90BD-2.17CD-15.77A2-13.80B2-9.51C2-6.66D2
　　 通过软件计算得到：当海藻糖取5.86％，A物质6.54％，甘油3.54％，B物质为4.01％时L.m的存活率可达到93.91％。为了验证最大预测值，在最优点做了3个重复实验得到，L.m的平均存活率为92.46％，与预测值很接近。
　　 在考查保护剂对菌体生物特性的保护作用时，对添加了保护剂的菌体进行活化5h然后测定其滴定酸度、与乳糖酶活力，得出用海藻糖、A物质、B物质和乳清保护下的菌体表现出较强的生理活性。
　　 在对冻干菌体进行电镜观察时我们发现，添加了保护剂后的冻干菌体表面被光滑的保护剂包裹住，不受外界环境的污染；而没有添加冻干保护剂的冻干菌体直接裸露在微粒的表面，在电镜下可以清晰的看到菌体的杆菌形态与球菌形态。由此直接得出冻干保护剂在冷冻干燥的整个过程有效的保护了菌体。
　　 直投式发酵剂的保藏实验得出，冻干菌体保藏在真空-18℃条件下可以更好的使菌体不失活。
　　 3、直投式发酵剂的发酵效果研究
　　 本实验采用顶空固相微萃取结合GC-MS对不同发酵方式发酵的泡菜中的挥发性物质进行了分析，分别从这两种发酵方式不同发酵时间的泡菜中分离鉴定出84、75、111、128种挥发性物质，说明顶空固相微萃取结合GC-MS能较好的分析泡菜中的挥发性物质。
　　 乙醇、乙酸、乙酸乙酯以及含有乙酸的化合物是由微生物发酵产生的，用DVU(直投式发酵剂)发酵5天后的泡菜中乙醇占总峰面积8.8％，乙酸2.21％，含有乙酸化合物占14.73％。传统发酵法发酵5天后的泡菜中乙醇占6.55％，乙酸0.81％，含有乙酸的化合物7种占总峰的7.81％；由此看来经DVU发酵5天后的泡菜中由微生物发酵所产生的特征芳香物质要多于传统发酵法发酵相同时间的泡菜。经DVU发酵15天后，乙醇占被测总峰的32％，含乙酸的化合物占总峰的5.58％，经传统发醇法发酵15天后检出乙醇占25.7％，含有乙酸的化合物占总面积的9.71％；经过更长时间的发酵，两种发酵法在由微生物发酵而产生的香气物质趋于接近。由此也可以说明，DVU发酵法相对于传统发酵方式来说可以缩短发酵时间。
　　 在四个样品中都检出的甲基二硫化碳，二甲基三硫，二烯丙基二硫和二烯丙基三硫被认为是泡菜的主要特征性气味，这些特征性的含硫化合物在DVU发酵5天，与传统法发酵5天的泡菜中分别检出所占的比例为44.2％，4.51％；DVU发酵15天，与传统法发酵15天中所占比例为12.78％，8.23％。由此可以看出，经DVU发酵的泡菜在特征香气的占比上比传统发酵法要高出很多，特别是在发酵到15天的时候，经过更长时间的发酵含硫化合物的占比在下降，这也和喻勇新等人在“研究泡菜在贮藏程中风味物质的变化”一文中的结果是一致的。
　　 经过对两种发酵方法的泡菜汁的酸度与pH值分析可知，用冻干菌发酵的泡菜产酸快，与传统发酵发相比可以缩短发酵时间近9天，用冻干菌发酵的泡菜在发酵8天时就可以成熟。
　　 为了得到直投式发酵剂发酵泡菜的最佳工艺，进行了正交实验，实验得出发酵温度为30℃，菌种配比为L.m：L.p为1:2，接种量为3％，发酵时间为5天。在此条件下发酵出来的泡菜香气浓郁，酸度适中，颜色鲜亮，口感适宜。
　　 冻干菌的保藏实验得出，冻干菌体保藏在真空-18℃条件下可以更好的使菌体不失活。
　　 结论：通过对菌体各个生长过程，菌体收集过程与冻干保护剂的优化组合可以将菌体的浓度做到预定的高度，以及在后续的冻干过程中有较高的存活率。将制得的直投式发酵剂放应运于果蔬的发酵可以缩短其发酵时间，以及控制发酵果蔬的品质。