结核病人与健康成人外周血γδT细胞Vδ1-8亚群分布的差异

摘要

背景：结核病是严重危害人类健康的常见感染性疾病之一，但关于机体抗结核感染的免疫机制尚未完全阐明。以往研究认为，αβT细胞中CD4+和CD8+T细胞，以及巨噬细胞在抗结核免疫中发挥关键性作用。近年来很多研究结果证实γδT细胞在抗结核杆菌感染免疫中也发挥重要作用。γδT细胞是与αβT细胞有不同特征的独特T细胞，许多研究表明γδT细胞在抗感染免疫、抗肿瘤免疫中发挥重要作用，同时γδT细胞在调节特异性免疫应答、自身免疫性疾病和变态反应性疾病的发生均有重要的参与作用。γδT细胞可产生多种细胞因子和趋化因子，在抗感染免疫，特别是在抗结核杆菌感染的早期免疫中可能发挥重要作用。γδT细胞根据δ链V区不同可分为8个亚群（Vδ1至Vδ8），正常人以为Vδ2亚群为主。有研究显示，在某些疾病患者γδT细胞中Vδ1和Vδ2亚群的比例明显改变。本研究室的前期研究中也观察到同样现象。我们关注的科学问题是：健康成年人与结核病人γδT细胞的Vδ1-8各亚群分布情况究竟是怎样的，健康成年人与结核病人是否有明显差异？尤其是Vδ1亚群和Vδ2亚群。
　　目的：调查健康成人外周血中Vδ1-8各亚群的分布情况和结核病人外周血中Vδ1-8各亚群的分布改变，通过研究对比，探讨γδT细胞Vδ1-8各亚群，特别是Vδ1亚群和Vδ2亚群在结核感染中可能发挥的不同作用。
　　方法：抽取一定数量健康成人和结核病人空腹静脉血于肝素钠抗凝管中备用，取试管与不完全1640培养液混匀，用人淋巴细胞分离液经密度梯度离心法获取外周血单个核细胞。用磷酸盐缓冲液洗涤后，调整细胞浓度5×106/ml－1×107/ml。
　　流式细胞仪检测法取上述细胞悬液，分别加入抗人 CD3-FITC，抗人CD3-APC，抗人Vδ1-PE，抗人γδ-TC，抗人Vδ1-FITC，抗人Vδ2-PE表面染色后，用流式细胞仪检测。数据分析采用Cell Quest软件，计算Vδ1+，Vδ2+细胞以及Vδ1－/Vδ2－(即Vδ3～8+)细胞各自在γδT细胞中的百分比。
　　荧光定量RT－PCR检测法取上述细胞悬液用Trizol裂解后提取RNA并用超微量核酸蛋白检测仪鉴定RNA质量，合格者用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒按标准加样后在PCR仪上逆转录得到cDNA，再将cDNA按标准加入SYBR Green Reagents荧光试剂，放入实时荧光定量PCR仪反应，反应参照基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。所得数据将δ1-8基因循环数与内参的差值?经过2-?换算后得到各基因相对表达量，并计算均数和标准差。
　　结果：⑴36例健康成年人中，流式细胞仪检测，大多数人γδT细胞δ2亚群所占比例最高；实时荧光定量 RT-PCR法检测 Vδ1-8基因，δ2基因相对表达量为0.0955±0.006，占总γδT细胞表达量的57.96％。其他基因按相对表达量由多到少排列，依次为δ3、δ1、δ7、δ8、δ4、δ5、δ6。⑵10例结核病人当中，流式细胞仪检测，大多数人γδT细胞主要以δ1亚群为主；实时荧光定量RT-PCR法检测δ1-8基因，δ1基因相对表达量为0.01723±0.0001，占总γδT细胞表达量的46.60%。δ2基因相对表达量为0.0042±0.0007，仅占总γδT细胞表达量的11.44%。其他基因按相对表达量由多到少排列，依次为δ5、δ6、δ4、δ7、δ3、δ8。⑶统计学验证相关系数，健康成年人组的Vδ1组，Vδ2组，Vδ1－/Vδ2－(即Vδ3-8+)组R2在0.941到0.985间，结核病人组的Vδ1组，Vδ2组，Vδ3-8组R2在0.967到0.990间，(P<0.05)。
　　结论：①流式细胞术和实时定量PCR技术检测发现，36例健康成年人γδT细胞亚群中，以Vδ2亚群比例最高（占总γδT细胞57.96%），其他亚群的比例由多到少依次为δ3、δ1、δ7、δ8、δ4、δ5、δ6。②与健康成年人不同，10例结核病人的γδT细胞主要以δ1亚群为主（占总γδT细胞46.60%），其他亚群的比例由多到少依次为δ5、δ6、δ2、δ4、δ7、δ3、δ8。③流式细胞仪检测法与实时定量 PCR检测法呈较强的线性正相关关系，统计学验证健康成年人组和结核病人组不同亚群，相关系数R2在0.941到0.990间。④结核病人Vδ2细胞亚群较健康成年人明显减少，而Vδ1细胞亚群相对增高。推断该Vδ2细胞亚群在结核感染中被消耗所导致。

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前 言

材 料 和 方 法

1. 实验材料

2、实验方法

3. 统计学处理

结果

1. 健康成年人γδT细胞δ1-8亚群分布

2. 结核病人γδT细胞δ1-8亚群分布

3. 健康成年人与结核病人外周血γδT细胞TCR分子δ1-8亚群分布的差异

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配制

附录C Vδ1-8及Cδ区基因序列

附录D健康成年人RT-PCR数据

附录E个人简历

附录F 综述:TH17细胞分化和IL-17产生调控机制的研究进展