NHDC拮抗D-GalN/LPS致暴发性肝衰竭和LPS致RAW246.7细胞炎症的机制分析

摘要

新橙皮苷二氢查尔酮（NHDC）是从柑橘类天然植物中提取的新橙皮苷经过氢化而成的黄酮类衍生物。它甜度高，热量小，无诱变性，无致癌性，无致龋行，无明显的毒性效应，对身体无不良的影响，代谢速度快。常被用作抑制苦味和改良风味的功能性甜味剂。近年来，国内外对NHDC的提取、合成和作为食品添加剂等方面进行了较深入的研究。但是，对于肝损伤的保护作用少见文献报道。本实验探究NHDC拮抗D-GalN/LPS所致小鼠急性肝损伤和LPS激活RAW264.7细胞炎症的机制研究。
　　第一部分、NHDC对D-GalN/LPS致暴发性肝损伤的保护作用和机制分析
　　目的：从体内研究新橙皮苷二氢査耳酮（NHDC）对D-半乳糖胺/脂多糖（D-GalN/LPS）致肝损伤的保护作用，并进一步探讨其分子机制。
　　方法：
　　将40只昆明种雄性小鼠随机分为4组：对照组，D-GalN/LPS组，NHDC组和D-GalN/LPS+NHDC组，每组10只。NHDC组和D-GalN/LPS+NHDC组分别灌胃给予NHDC（200mg/kg）预处理6天，对照组和D-GalN/LPS组仅给予5％的羧甲基纤维素钠预处理，然后对照组和NHDC组腹腔注射生理盐水，余2组分别腹腔注射D-GalN（400mg/kg）/LPS（10μg/kg），建立暴发性肝损伤小鼠模型。观察造模后24h内各组小鼠的生存情况，每两小时记录小鼠的存活数，绘制小鼠生存曲线图，进行生存分析。
　　结果：
　　1.与D-GalN/LPS组比较，D-GalN/LPS+NHDC组小鼠24h存活率明显提高；D-GalN/LPS+NHDC组小鼠血清ALT、AST、NO水平明显降低，肝组织病理损伤明显改善；
　　2.与D-GalN/LPS组比较，D-GalN/LPS+NHDC组肝组织中MDA、ROS、COX2、PGE2水平和iNOS活力显著降低；D-GalN/LPS+NHDC组肝组织中GSH水平升高和CAT、SOD、GPx活力明显增强；
　　3.与D-GalN/LPS组比较，D-GalN/LPS+NHDC组肝组织中炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和TLR4信号通路相关蛋白的表达显著降低。
　　4.与D-GalN/LPS组比较，D-GalN/LPS+NHDC组的巨噬细胞的数量减少。
　　结论：NHDC对D-GalN/LPS诱导小鼠暴发性肝损伤具有明显的保护作用，其机制可能是通过减轻氧化应激，抑制TLR4信号通路的表达，从而抑制肝细胞的炎症有关。
　　第二部分、NHDC拮抗LPS致RAW246.7细胞炎症和机制分析
　　目的：LPS刺激RAW264.7细胞，建立体外炎症模型。观察橙皮苷二氢査耳酮对LPS诱导RAW264.7细胞的存活率的影响，对TLR4信号通路相关蛋白的表达的影响，对LPS与TLR4结合的影响，对LPS诱导TLR4易位到脂伐的影响。探讨NHDC抗内毒素的作用及其机制。
　　方法：
　　将40只昆明种雄性小鼠随机分为4组（同上），每组10只。造模及NHDC预处理同上，于造模后6h处死全部小鼠。取血清标本，检测 ALT、AST和NO水平；观察肝脏大体形态，H&E染色，进行肝组织病理分析；采用试剂盒测定肝脏GSH、MDA、ROS水平、抗氧化酶（CAT、SOD、GPx）和iNOS的活力；采用ELISA试剂盒测定肝脏COX2和PGE2的水平；免疫组化法检测TLR4和MyD88的表达情况；采用EMSA法检测NF-κB和AP-1的结合活性；Western Blotting技术检测肝组织炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）与TLR4信号通路相关蛋白的表达；采用组织免疫荧光检测肝组织中巨噬细胞的产生情况。
　　MTT法检测RAW264.7细胞存活率；瞬时转染技术，检测NHDC对LPS诱导TLR4信号通路的影响；免疫荧光法和流式细胞术，检测NHDC对LPS与TLR4结合的影响；蔗糖密度梯度离心法，研究NHDC对LPS诱导TLR4易位到脂伐区的影响。Western Blotting法，检测Nrf2蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1.10ug/ml的LPS，和预处理NHDC（10μM、30μM、50μM）1h后给予LPS处理6h对RAW264.7细胞的存活率没有影响；
　　2.RAW264.7细胞转染siRNA-TLR4后，TLR4以及下游蛋白P65、c-jun、c-fos、p-IRF3的表达均被抑制。但转染siRNA-MyD88后，下游蛋白P65、c-jun、c-fos的表达被抑制，但是TLR4和p-IRF3的表达未被抑制；
　　3.用免疫荧光法和流式细胞术分析发现NHDC能够抑制LPS与TLR4的结合；
　　4.与LPS组相比，预处理NHDC能够抑制TLR4易位到脂伐区；
　　5.与LPS组相比，NHDC能够促进Nrf2的表达增加。细胞转染siRNA-Nrf2后，LPS诱导的TLR4的表达增加，但NHDC仍能部分抑制TLR4的表达。
　　结论：NHDC通过抑制LPS与TLR4结合，抑制TLR4易位到脂伐区，增加Nrf2的表达来拮抗LPS诱导RAW264.7细胞产生的炎症。

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引言

第一章 NHDC对D-GalN/LPS致暴发性肝损伤的保护作用和机制分析

1.1材料和方法

1.1.1实验材料

1.1.2 实验方法

1.2结果

1.2.1 NHDC拮抗D-GalN/LPS诱导小鼠的存活率下降

1.2.2 NHDC改善D-GalN/LPS诱导的小鼠肝脏组织病理学损伤

1.2.3 NHDC拮抗D-GalN/LPS 诱导的血清转氨酶水平升高

1.2.4. NHDC下调D-GalN/LPS 诱导的 ROS和MDA的水平，增高肝脏内 GSH水平

1.2.5 NHDC改善D-GalN/LPS诱导的抗氧化物酶的活力

1.2.6 NHDC改善D-GalN/LPS诱导的炎症分子的产生

1.2.7 NHDC抑制D-GalN/LPS诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α的表达

1.2.8 NHDC抑制D-GalN/LPS诱导的TLR4和MyD88的表达

1.2.9 NHDC抑制D-GalN/LPS诱导的NF-κB信号通路激活

1.2.10 NHDC抑制D-GalN/LPS诱导的MAPK信号通路激活

1.2.11 NHDC抑制D-GalN/LPS诱导的TRIF信号通路激活

1.2.12 NHDC抑制D-GalN/LPS诱导巨噬细胞的产生

1.3讨论

1.4 小结

第二章 NHDC拮抗LPS致RAW246.7细胞炎症和机制分析

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果

2.2.1 NHDC抑制LPS诱导的TLR4信号通路激活

2.2.2 NHDC抑制LPS与TLR4的结合

2.2.3 NHDC抑制LPS诱导TLR4易位到脂伐区

2.2.4 NHDC上调LPS诱导Nrf2的表达来抑制TLR4的表达

2.3讨论

2.4.小结

全文总结

创新点及意义

思考与展望

参考文献

文献综述:LPS/TLR4信号转导通路

致谢

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