香叶木素通过ULK1/FUNDC1通路诱导HepG2细胞自噬和增殖抑制作用的研究

摘要

目的： 1.观察不同浓度香叶木素对HepG2细胞增殖的影响。 2.通过明确HepG2细胞中ULK1与FUNDC1信号通路的相互作用，阐明香叶木素诱导HepG2细胞自噬和增殖抑制作用的机制。 3.探索香叶木素作为抗肿瘤药物的理论依据。 方法： 1. CCK-8实验检测香叶木素对HepG2细胞增殖作用的影响。 2.透射电镜扫描观察香叶木素对HepG2细胞处理后胞内自噬水平。 3.应用Lipofectamine?3000转染试剂向HepG2细胞转入GFP-LC3质粒，激光共聚焦显微镜下观察香叶木素对HepG2细胞处理后胞内GFP-LC3质粒水平。 4. Western blotting法检测香叶木素处理 HepG2细胞后胞内 ULK1、FUNDC1、LC3蛋白的相对表达量。 5.荧光实时定量 PCR法检测香叶木素处理 HepG2细胞后 ULK1，FUNDC1 mRNA表达水平。 6.荧光实时定量PCR法检测不同siRNA处理HepG2细胞后对FUNDC1 mRNA的敲低水平。 7. Western blotting法检测不同siRNA处理HepG2细胞后FUNDC1蛋白的相对表达量。 8.敲低HepG2细胞中FUNDC1后，CCK-8实验检测香叶木素对HepG2细胞增殖的影响。 9.敲低HepG2细胞FUNDC1后，Western blotting法检测香叶木素处理HepG2细胞对ULK1，FUNDC1，LC3蛋白表达的影响。 10.敲低HepG2细胞FUNDC1后，透射电镜扫描观察香叶木素对HepG2细胞自噬水平的影响。 结果： 1.香叶木素处理HepG2细胞24 h，在5μg/ml~100μg/ml浓度梯度HepG2细胞的平均抑制率呈递增趋势。 2.香叶木素处理HepG2细胞24 h，通过透射电镜扫描显示，给药组HepG2细胞内自噬体比对照组多，且随着香叶木素浓度的升高,胞内自噬体增多。 3.应用Lipofectamine?3000转染试剂向HepG2细胞转入GFP-LC3质粒并予香叶木素处理24h，激光共聚焦显微镜显示，给药组HepG2细胞内GFP-LC3质粒比空白对照组多，且随着香叶木素浓度的增加，质粒荧光明显增多。 4.香叶木素处理 HepG2细胞24h，Western bloting结果显示 ULK1、FUNDC1蛋白相对表达量增多，LC3Ⅰ型向Ⅱ型转变增多，并随着药物浓度增加而呈递增趋势。 5.香叶木素处理HepG2细胞24h，荧光实时定量PCR结果显示ULK1，FUNDC1 mRNA相对表达量均随着药物浓度增加而呈递增趋势。 6.不同siRNA处理HepG2细胞24h，荧光实时定量PCR及Western bloting结果显示siRNA-mus-478能使FUNDC1 mRNA及蛋白表达量显著降低。 7.敲低 HepG2细胞中的 FUNDC1后，并予香叶木素处理24h，在5μg/ml~20μg/ml浓度梯度HepG2细胞的平均抑制率上升趋势缓慢，且比未敲低组显著下降。 8.敲低HepG2细胞中的FUNDC1后，香叶木素（浓度为20μg/ml）再处理24小时，电镜扫描结果发现，FUNDC1(KD) DIOS(+)组与FUNDC1(+) DIOS(+)相比，细胞内的自噬体个数明显减少，而 FUNDC1(KD) DIOS(0μg/ml)组与FUNDC1(KD) DISO(+)组的胞内的自噬体个数无明显变化。 9.敲低HepG2细胞中的FUNDC1后，香叶木素（浓度为20ug/ml）再处理24小时，Western检测结果 FUNDC1(KD)DISO(+)组)与FUNDC1(normal)DIOS(+)组相比，LC3Ⅰ型向Ⅱ型转变明显下降。 结论： 1.香叶木素对人肝癌细胞株HepG2有明显的增殖抑制作用，并呈浓度依赖性。 2.香叶木素通过ULK1/FUNDC1通路诱导HepG2细胞自噬和增殖抑制作用。 3.体外实验证明香叶木素能明显抑制HepG2细胞增殖作用，由此推测香叶木素具有潜在的抗肿瘤治疗作用。