大鼠肠粘蛋白rMuc3 SEA组件内N-糖苷型糖链在其翻译后修饰中的作用的研究

摘要

目的: 探讨大鼠粘蛋白rMuc3 SEA组件内7个N-糖苷型糖链对LSKGSIVV基序酶切的影响、及其在酶切后氨基端和羧基端两个裂解片段连接和rMuc3羧基端细胞膜定位中的作用。 方法: 以p20为模板(含Muc3羧基端cDNA的真核表达载体)，采用定点突变技术去除糖基化位点后得到各种单阴性突变体和多重阴性突变体，并经测序验证。收集各阴性突变体及p20用脂质体转染COS-7细胞，通过Western blotting利用抗V5抗体或抗Myc抗体鉴定细胞裂解产物，使用NBT/BCIP底物检测阳性条带。用FITC标记的羊抗小鼠二抗观察胞浆和胞膜上的荧光分布，以评价其在细胞内的膜定位情况。 结果： 1、使用PCR定点突变的方法，获得各阴性突变体，经序列测定后利用clustalx1.83软件与相应模板比对，证实突变完全成功。并通过质粒中量提取获得了足量的质粒用于转染。 2、收集细胞溶解产物用抗V5抗体在p20和N4A，N5A，N6A和N7A检测到氨基端分子量为26-30 kDa.的产物，主要位于30 kDa，30 kDa以下代表不完全酶切部分。而N1A，N2A或N3A氨基端分子量基本为26 kDa或26 kDa以下不完全酶切的部分。抗myc抗体检测NIA，N2A，N3A和p20的C端片段的分子量主要是49kDa，在47kDa处有一条由于不完全糖基化的较浅的条带。N4A、N5A、N6A和N7A酶切后C端的分子量主要是45kDa和46kDa，低于野生型p20 C端酶切片段的分子量(49 kDa)。 3、N34A、N345A、N3457A和N34567A的N端酶切片段的分子量和单突变体N3A相似，均大约是26kDa。六重突变体N134567A和N234567A的N端酶切片段的分子量相同，均降为了23kDa。在N34A、N345A、N3457A、N34567A、N234567A和N134567A，表达产物的C端酶切片段的分子量逐渐降低，而七重突变体N1234567A的C端片段则消失了。 4、去除了所有7个N型糖基化位点的N1234567A转染后的产物100％未被酶切，可以同时被抗V5抗体和抗myc抗体识别。六重突变体N134567A和N234567A分别有85.03％和72.89％未酶切产物。只含有两个N-糖苷型糖链的N34567A有48.34％的未酶切产物。而含有三个N-糖苷型糖链的N3457A则只有1.99％的未酶切部分。N34A和N345A的结果与p20的结果相似，几乎完全酶切。 5、各种N糖苷型糖链阴性突变体和野生型p20的培养上清中通过免疫反应没有检测出相应的N端片段。 6、免疫荧光实验中看到N2A、N234567A和N1234567A在细胞固定和不固定情况下细胞膜上均未出现荧光，其余各种N糖苷型糖链阴性突变体在固定和不固定两种情况下的荧光分布与野生型p20相似。 结论：以p20为模板的各种突变体突变成功，以脂质体转染法将所有突变体导入COS-7细胞并获得了相应突变体的高效表达。通过Western blotting免疫印迹实验结果证实了理论推测的7个N型糖基化是实际存在的。大鼠粘蛋白rMuc3 SEA组件内的7个N-糖苷型糖链有利于其在内质网中位于LSKG/SIVV基序内的酶切，但对于酶切后两个片段的连接没有影响。N2位的糖链对于其在真核细胞内的膜定位是至关重要的，其余各糖链无论是单个还是联合作用均对膜定位没有影响。此结果对于囊性纤维化病的治疗有一定的理论指导意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前 言

第一部分大鼠肠粘蛋白rMuc3 SEA组件内N-糖苷型糖链阴性突变体表达载体的构建

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分大鼠肠粘蛋白rMuc3 SEA组件内N-糖苷型糖链对其蛋白酶切的影响

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分大鼠肠粘蛋白rMuc3 SEA组件内N-糖苷型糖链对其酶切后片段的连接及膜定位的影响

材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述糖蛋白中N-型糖基化的研究进展

攻读硕士学位期间撰写论文情况