MDR1基因与白色念珠菌毒力相关性及药物联用治疗感染小鼠的研究

摘要

目的:
　　耐药白色念珠菌的治疗一直是临床关注的问题，耐药白色念珠菌多药耐药基因MDR1的高表达是否引起毒力变化，也是有争议的话题。利用MDR1基因高表达的耐药白色念珠菌CaR建立弥散性感染小鼠模型。在此基础上，利用基因工程改造菌株CaDEL（MDR1基因敲除菌株）、CaCOM-A（MDR1敲入菌株）、CaCOM-B（MDR1敲入菌株）感染小鼠，进行MDR1基因与白色念珠菌毒力相关性研究，探讨MDR1高表达是否对毒力有影响。同时，开展抗耐药真菌药物的筛选，建立药物的体内筛选系统。
　　方法：
　　将耐药白色念珠菌CaR尾静脉接种免疫抑制ICR小鼠，建立弥散性感染小鼠模型，评价感染小鼠的生存状况和平均生存时间；采集感染小鼠的肾、心、脑、肺、脾、肝组织进行组织载菌量检测和病理诊断；利用流式微球分析技术（CBA）检测血液和肾组织的细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL12p70、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF的变化；在此基础上，利用基因工程改造菌株CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B感染小鼠，评价MDR1基因对小鼠毒力的影响，以及检测感染肾组织白色念珠菌的AFT2、CEK1、CPH1、CPP1、EFG1、FLO86个菌丝相关毒力因子和ALS1、ALS5、HGC1、HWP1、INT1、MNT1、PMT1、PMT6、TCC1、TEC1、TPK2、TUP112个粘附相关毒力因子的变化；并利用建立的耐药白色念珠菌弥散性感染小鼠模型，口服给予氟康唑、原黄素、联合药物，进行模型应用评价研究。
　　结果：
　　1.建立耐药白色念珠菌弥散性感染小鼠模型
　　CY免疫抑制ICR小鼠接种1.0×105CFU CaR，14天内死亡率约为90％。临床表现：虚弱，立毛，眼部出现分泌物，打转，偏头症状、死亡。解剖显示：肾组织肿大，出现白色斑点，脑组织表面散布出血点。载菌量检测：肾、心、脑、肺、脾、肝组织都检出白色念珠菌，肾的载菌量最高，其次是心、脑、肺、脾、肝；随着感染时间的推移，各组织中的载菌量数逐渐减少；组织病理诊断：HE染色可见组织炎性细胞浸润，其中，肾组织可见真菌性肉芽肿病理变化；PAS染色可见白色念珠菌分布在各组织中。细胞因子检测：感染小鼠显示急性非特异性炎症反应。血液中IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-1β与对照组相比出现明显升高，其它细胞因子未见明显变化；肾组织细胞因子与对照组相比，IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF含量升高，IL-4、IL-10含量降低。
　　2.评价MDR1基因高表达对白色念珠菌毒力的影响
　　与MDR1基因相关的四种白色念珠菌CaR、CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B分别感染免疫抑制的ICR小鼠，均显示典型的弥散性白色念珠菌感染，感染动物14天内死亡率约为90%，四组感染动物之间生存无显著性差异。感染第6天小鼠相关检测结果显示：肾、心、脑、肺、脾、肝组织载菌量无显著性差异；组织病理诊断也无显著差异；细胞因子检测结果显示CaDEL组与其他组相比，血液中IL-6、IL-10、TNF-α升高，肾组织中IL-1α和TNF-α升高，IL-4、IL-5、IL-6、IL-15、IL-17降低，但是这些差异性并未影响毒力；毒力因子检测结果显示，CaR与CaDEL相比，相关毒力因子均表现显著性差异，然而CaCOM-A、CaCOM-B与CaDEL相比，无显著性差异。虽然MDR1高表达野生菌株CaR中检测到12种毒力基因的表达升高，但是通过敲入方式获得的MDR1基因高表达的CaCOM-A、CaCOM-B菌株未显示毒力基因表达差异性，因此，单一MDR1基因的高表达不能引起菌株毒力变化。
　　3.评价药物在耐药白色念珠菌感染模型上的应用
　　利用耐药白色念珠菌弥散性感染小鼠模型，开展原黄素、氟康唑及联合用药评价，结果显示原黄素治疗感染小鼠无效，8mg/kg为氟康唑治疗感染小鼠的有效剂量，100mg/kg原黄素或2mg/kg氟康唑和16mg/kg原黄素联用未见明显药效。
　　结论：
　　1.成功建立了耐药白色念珠菌弥散性感染小鼠模型，并提供了动物生存、组织载菌量、组织病理、细胞因子等指标。
　　2.CaR、CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B感染小鼠相关指标检测显示 MDR1基因单一高表达不影响白色念珠菌毒力。
　　3.8mg/kg氟康唑能有效改善耐药白色念珠菌感染小鼠的生存，100mg/kg原黄素或2mg/kg氟康唑和16mg/kg原黄素联用都不能有效改善感染小鼠的生存。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

序言

1 研究背景

2研究创新点

实验部分

实验材料

第一部分 耐药白色念珠菌弥散性感染小鼠模型建立

1实验方法

2 实验结果

3 实验结论

第二部分 MDR1基因对白色念珠菌毒力的影响

1 实验方法

2 实验结果

3 实验结论

第三部分 耐药白色念珠菌感染模型的应用

1 实验方法

2实验结果

3实验结论

讨论

1 耐药白色念珠菌小鼠模型的建立

2 MDR1与白色念珠菌毒力相关性

3 联合用药治疗白色念珠菌感染

结论

参考文献

文献综述:中药治疗白色念珠菌感染的研究现状

致谢

附录一 缩写词中英文对照

附录二 硕士在读期间科研情况