急性肾损伤生化标志物NGAL免疫学检测体系及其初步临床应用

摘要

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)是Kjeldsen等人1993年研究中性粒细胞中92kDa的明胶酶,即MMP-9时发现的一种新的脂质运载蛋白(又名lipocalin)。NGAL存在于中性粒细胞中的过氧化物酶阴性颗粒中,并在人体组织细胞中广泛分布,如支气管、胃、小肠、胰腺、肾、前列腺、胸腺等。研究表明,NGAL蛋白具有运输疏水性小分子、调节MMP-9活性、参与体内Fe转运等功能,并可能参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展,特别是肿瘤的浸润转移等过程。近年研究发现,NGAL与肾脏关系十分密切。NGAL通过介导铁的转运来刺激早期原始肾脏系膜细胞转化为肾脏上皮细胞,从而启动肾脏发育。此外,NGAL可以通过转运细胞内铁从而消除铁在细胞内堆积引起的细胞损伤,也可以引起白细胞凋亡减轻炎症反应而发挥保护肾脏的作用。众多实验室和临床研究表明,肾损伤时NGAL表达明显增高并分泌释放入体液中。尤其是尿液中的NGAL水平与肾脏损伤的程度密切相关且很早就表现出来,NGAL被认为是新的早期肾损伤生化标志物。为将NGAL转化入临床应用,制备特异性NGAL抗体并建立相应的NGAL免疫检测方法非常重要。在本研究中,我们利用生物信息学工具分析NGAL蛋白的性质并通过HEK293T细胞重组表达了重组人NGAL蛋白(rhNGAL)作为抗体制备的筛选原和标准品。以购买的NGAL重组蛋白为免疫原制备出特异性NGAL单克隆抗体并建立起NGAL免疫学检测方法。在此基础上以293T细胞表达的rhNGAL为标准品对该方法进行全面的方法学评价,最后对57例临床标本进行了检测,初步证明本检测方法能够区分正常标本和肾脏损伤标本NGAL水平的差异。
　　主要研究内容和结果
　　1.pcDNA3.1/HisA-NGAL的构建及其在HEK293T细胞中的表达和纯化
　　通过分子生物学软件工具的预测发现NGAL蛋白且具有较多的糖基化位点和磷酸化位点,说明NGAL蛋白翻译后修饰加工和蛋白结构比较复杂,原核表达的蛋白不易形成正确的蛋白构象,难以获得理想的检测抗体。鉴于NGAL分子特点和前期工作经验,本研究利用基因工程技术构建了pcDNA3.1/HisA-NGAL真核表达载体,在HEK293T细胞中表达rhNGAL并进行纯化,获得0.18mgrhNGAL用作制备单克隆抗体筛选原和标准品,为下一步研究奠定必要的基础。
　　2.抗人NGAL单克隆抗体的制备和鉴定
　　利用购买的NGAL重组蛋白作为免疫原经皮下多点注射和腹腔注射途径免疫Balb/c小鼠,经两次细胞融合和筛选获得10株分泌抗NGAL的单克隆抗体细胞株,经进一步检测筛选最后制备获得4株高效特异的抗NGAL单克隆抗体。随后利用ELISA和WB等方法对4株抗体进行了鉴定:4株抗体亚类如下:1-F2,1-G2和4-H11是IgG1,1-H5是IgG2b。4株抗体抗原结合力强,特异性良好,不与无关蛋白反应。在IHC染色中4株抗体均可以与肾组织切片中天然抗原结合,阳性主要定位于肾小管上皮细胞胞浆中。通过截短表达NGAL蛋白和合成B细胞表位肽的方法鉴定抗体的抗原表位,其中单克隆抗体1-H5的B细胞表位位于NGAL蛋白第20至36位氨基酸处。而其余3株抗体无法与截短的NGAL蛋白片段和表位肽反应。本部分工作成功制备了特异性好、效价高的NGAL单克隆抗体,为下一步NGAL免疫学检测方法的建立奠定了基础
　　3.NGALELISA定量检测方法建立和初步临床应用研究
　　本研究以第二部分制备获得的高效特异性单克隆抗体为原料,两两配对筛选,建立了以1-F2为捕获抗体,酶标1-G2为检测抗体的双抗体夹心ELISA方法。应用棋盘滴定法确定ELISA体系最佳工作条件。通过方法学评价可知本方法线性范围0~40ng/ml,灵敏度达到4.8ng/ml,平均回收率101.9％,最大批内CV≤10.04%,最大批间CV≤9.76%。我们收集了57例临床尿液标本,其中24例为正常对照组,33例为肾损伤患病组。用本ELISA系统进行样本检测,患病组尿液NGAL水平明显高于正常对照组尿NGAL水平,有统计学意义(P<0.01)。随后选取3例肾病患者尿液和1例健康体检者尿液为抗原,1-F2和1-G2为一抗做WB分析表明肾病患者尿液标本出现阳性条带而体检者尿液标本为阴性,表明1-F2和1-G2单克隆抗体能够识别体液标本中天然抗原。本ELISA检测体系经方法学评价,各方面参数良好,临床小样本检测与临床诊断相符,为研发具有自主知识产权的NGAL免疫检测试剂并以此为基础发展NGAL其他灵敏快捷的相关医学检验技术奠定了基础。

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缩略语表

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第一章 前言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 pcDNA3.1/His A-NGAL的构建及其在HEK293T细胞中的表达和纯化

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 抗人NGAL单克隆抗体的制备和鉴定

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 NGAL的定量ELISA检测方法建立和初步临床应用研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述NGAL测定在急性肾损伤诊断中的应用研究进展

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢