肿瘤干细胞促卵巢癌淋巴管生成及转移的作用及机制研究

摘要

卵巢癌为女性常见恶性肿瘤,死亡率居妇科恶性肿瘤首位,卵巢癌的侵袭性生长与转移是其预后不良的主要原因。研究已经发现卵巢癌组织中的脉管生成在肿瘤侵润生长与转移中扮演重要角色,但一直以来关于肿瘤脉管生成的研究主要集中在血管方面,对淋巴管的研究较少。临床观察发现高淋巴管密度与卵巢癌腹膜转移、远处转移及淋巴结转移显著相关,淋巴管生成在肿瘤淋巴转移起了重要作用。随着淋巴管特异性内皮细胞标记物的发现和淋巴管生成调控因子研究的深入,淋巴管生成对肿瘤侵袭转移的重要性逐渐得以认识,但其机制尚未明确。
　　近年来,肿瘤干细胞理论研究结果显示肿瘤组织内存在着极少数能自我更新、多向分化、高致瘤性的肿瘤干细胞是肿瘤发生、侵袭、转移和复发的根源。对卵巢癌的研究有类似发现,卵巢癌的发生、侵袭、转移与其体内存在的数量极少的肿瘤干细胞相关。而肿瘤的生长、侵袭和转移除肿瘤细胞自身的生物学行为以外,尚有血管、淋巴管生成以提供养料,同时肿瘤组织的脉管生成在肿瘤的转移中起重要作用。因此,研究肿瘤干细胞与淋巴管内皮细胞间的相互作用,以探索肿瘤干细胞在卵巢癌淋巴转移中的作用有重要意义。另外,肿瘤干细胞通过何种机制参与卵巢癌的淋巴转移?目前研究的热点集中在SDF-1/CXCR4信号轴,SDF-1/CXCR4信号轴参与体内多种生理、病理过程,与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。新近的研究还发现SDF-1/CXCR4轴与肿瘤淋巴转移相关。卵巢癌患者腹水中检测到高水平SDF-1,卵巢癌组织高表达CXCR4,SDF-1在淋巴组织中高表达,高表达CXCR4的肿瘤细胞受SDF-1的趋化作用而发生淋巴转移。然而SDF-1在卵巢癌干细胞与淋巴管生成中的作用尚未见报道,需进一步研究。
　　卵巢癌的淋巴管生成和转移除了肿瘤干细胞的参与外,循环中淋巴管内皮祖细胞是否具有同样重要作用尚不清楚。实验已经发现外周血中骨髓来源的淋巴管内皮祖细胞参与了淋巴管新生,新近研究还发现肿瘤患者出现外周血淋巴管内皮祖细胞增多,淋巴管内皮祖细胞被动员参与肿瘤淋巴管生成。淋巴管内皮祖细胞参与淋巴管新生的机制极其复杂,涉及动员、趋化迁移、分化等多个环节,目前仅认为VEGF-C/VEGFR-3信号途径在其中起着重要的调控作用,具体机制尚不清。
　　在本研究中,首先,我们采用无血清悬浮培养法富集卵巢癌A2780细胞系中的细胞球,以CD133作为标记分子,用流式细胞仪从细胞球中分选出CD133+细胞,通过对CD133+自我更新、多向分化、致瘤性、干细胞标志基因等多种生物学特征进行检测,其生物学行为具备目前肿瘤干细胞的生物学特点,鉴定其为卵巢癌干细胞,为后续实验展开打下基础。然后,我们利用Transwell小室对CD133+细胞和本课题组前期建株的人淋巴管内皮细胞共培养,观察共培养时两种细胞的相互作用。一方面观察共培养对淋巴管内皮细胞增殖的影响,用酶联免疫吸附实验检测上清液中细胞因子VEGF-C的浓度,同时观察共培养对淋巴管内皮细胞迁移的影响,用RayBio?人细胞因子抗体芯片对淋巴管内皮细胞上清液进行细胞因子芯片筛查,对其中差异表达的趋化因子SDF-1用酶联免疫吸附实验进行验证,并进一步观察了上调和下调SDF-1对淋巴管内皮细胞迁移的影响。另一方面我们用WB检测了CD133+细胞CXCR4蛋白的表达,观察了共培养对卵巢癌CD133+细胞侵袭的影响,以及共培养后卵巢癌CD133+细胞VEGF的表达。与此同时我们用流式细胞仪检测了卵巢癌患者外周血中淋巴管内皮祖细胞/CD34+VEGFR3+细胞的含量,酶联免疫吸附实验检测了患者外周血中VEGF-C、SDF-1的浓度,对淋巴管内皮祖细胞和患者临床资料进行相关性分析,并对淋巴管内皮祖细胞与外周血VEGF-C、SDF-1的浓度进行了相关性分析。主要的结果和结论如下:
　　1、卵巢癌A2780细胞系中存在极少量的CD133+细胞,可通过悬浮条件培养法富集,流式细胞仪分选得到CD133+细胞。悬浮培养方法简单,重复性强,CD133+细胞比例稳定在0.2％左右。卵巢癌CD133+细胞能自我更新、多向分化,致瘤性强,多种干细胞标志基因高表达,符合肿瘤干细胞的特征。CD133是其特异性表面标志,能用于后续卵巢癌干细胞研究中干细胞的分选和鉴定。
　　2、卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养对淋巴管内皮细胞和卵巢癌干细胞生长均产生作用。观察发现共培养时淋巴管内皮细胞增殖增加,ELISA检测共培养上清液VEGF-C含量明显升高。共培养时时淋巴管内皮细胞迁移增加,其共培养上清液中出现多种细胞因子差异表达,39种细胞因子上调,5种细胞因子下调,ELISA检测验证上清液中上清液SDF-1含量明显升高,在上调和下调了SDF-1的共培养体系中,SDF-1对淋巴管内皮细胞的迁移产生影响,100ng/mlSDF-1促进淋巴管内皮细胞迁移的作用明显,而拮抗剂AMD3100在75ug/ml则明显抑制淋巴管内皮细胞的迁移。观察还发现卵巢癌干细胞CXCR4高表达,卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养时卵巢癌CD133+细胞侵袭能力增加,WB结果显示共培养后卵巢癌干细胞VEGF表达上调。
　　3、卵巢癌患者外周血中淋巴管内皮祖细胞含量升高,与患者肿瘤淋巴转移和临床分期相关。同时卵巢癌患者外周血中SDF-1和VEGF-C水平明显升高,淋巴管内皮祖细胞水平升高与SDF-1升高有相关性。
　　综上所述,CD133是卵巢癌A2780干细胞的特异标志因子,卵巢癌干细胞可用悬浮培养结合流式细胞仪分离。卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养时两细胞生长互相作用,共培养时淋巴管内皮细胞增殖迁移增加,卵巢癌干细胞侵袭能力加强。SDF-1/CXCR4信号轴参与了其中的调控。卵巢癌患者外周血淋巴管内皮祖细胞升高,淋巴管内皮祖细胞与肿瘤淋巴转移相关,并与外周血SDF-1升高有相关性。

目录

封面

声明

目录

英文摘要

中文摘要

第一章 前 言

第二章 卵巢癌干细胞的分离及生物学特征分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

第三章 卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养的实验研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 淋巴管内皮祖细胞对卵巢癌患者淋巴转移的影响研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 结论

全文总结

参考文献

文献综述一卵巢癌干细胞分离的研究进展

参考文献

文献综述二SDF-1/CXCR4与肿瘤的侵袭转移

参考文献

攻读博士学位期间发表论文

致谢