DNA修复基因(XRCC1、OGG1)单核苷酸多态性与胰腺癌易感性的关联性研究

摘要

研究目的:
　　1.探讨人类X-射线交叉互补修复基因1(XRCC1) c.1471G>A单核苷酸多态性与胰腺癌发病风险的相关性。
　　2.研究人类X-射线交叉互补修复基因1(XRCC1) c.1686C>G单核苷酸多态性与胰腺癌发病风险的相关性。
　　3.研究人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶基因1(OGG1) c.269C>A单核苷酸多态性与胰腺癌发病风险的相关性。
　　4.探讨人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶基因1(OGG1) c.627T>C单核苷酸多态性与胰腺癌发病风险的相关性。
　　材料和实验方法:
　　1.对于XRCC1基因研究中:病例组为328例汉族胰腺癌患者静脉血液样本;对照组为350例排除肿瘤性疾病的同期住院患者静脉血液样本,胰腺癌发病风险因素选择性别、年龄、饮酒、吸烟、糖尿病、体重指数、家族史因素等。所有病例均来自第三军医大学三所附属医院,住院时间从2009年1月至2012年10月。
　　2.在人OGG1基因研究中:将347例汉族胰腺癌患者静脉血液样本纳入病例组;364例排除肿瘤性疾病的同期住院患者静脉血液样本纳入对照组,胰腺癌发病风险因素选择性别、年龄、饮酒、吸烟、糖尿病、体重指数、家族史因素等。所有病例均来自从2009年1月至2012年10月的第三军医大学三所附属医院住院患者。
　　3.采用病例-对照研究方法,CRS-PCR分型技术对X R C C1基因c.1471G>A多态基因型进行检测;以PCR-RFLP对c.1686C>G位点多态基因型进行检测。利用卡方(X2)检验分析,以评估基因型和等位基因频率的Hardy-Weinberg平衡。针对临床胰腺癌发病相关因素,通过卡方(X2)检验分析,筛选影响胰腺癌发病的独立危险因素。非条件Logistic回归分析来估计比值比(OR)及其95％可信区间(CI),对上述单核苷酸多态性与胰腺癌风险性行关联分析,P值<0.05表示有显著统计学意义。
　　4.采用病例-对照研究方法,以PCR-RFLP及PCR-RFLP分型技术对O G G1基c.269C>A、 c.627T>C位点多态基因型进行检测。针对临床胰腺癌发病相关因素,通过卡方(X2)检验分析,筛选影响胰腺癌发病的独立危险因素。利用卡方(X2)检验分析,以评估基因型和等位基因频率的Hardy-Weinberg平衡,选择非条件Logistic回归分析方法,对上述单核苷酸多态性与胰腺癌遗传易感性进行关联分析,P值<0.05表示有显著统计学意义。
　　实验结果:
　　1.总共有678名受试者参与人类XRCC1基因2个单核苷酸多态性位点与胰腺癌风险性关联的研究中,其中包括328胰腺癌患者和350名健康对照者。
　　就胰腺癌组与对照组在性别,年龄,吸烟情况,饮酒,体重指数,糖尿病,和胰腺癌家族史的对照研究中,提示病例组和无癌对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg分布(P值均>0.05),表明入选病例样本具有群体代表性。
　　2.研究中验证了XRCC1两个多态位点有基因突变的情况存在。
　　人类XRCC1 cDNA1471位点上G与A之间的变异;人类XRCC1基因cDNA1686位点上 C与G之间的变异。其中 cDNA1471位点上的突变属于非同义突变,采用CRS-PCR方法进行基因分型,显示XRCC1基因13号外显子上G到 A的突变,导致编码的氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸(Glu491Lys, GenBank IDs:NC_000019.9, NM_006297.2, and NP—006288.2)。这种遗传变异的PCR扩增产物用AlwNI限制性内切酶,并分成3种基因型:GG(198bp和19bp),GA(217 bp,198 bp,和19 bp)和AA(217 bp)。cDNA1686位点突变是同义突变,采用PCR-RFLP检测方法进行基因分型。它在人类XRCC1基因的15号外显子中造成C到 G的突变(亮氨酸562亮氨酸)。这种遗传变异的PCR扩增产物被M boI限制性内切酶分为3种基因型:CC(232bp),CG(232bp,181bp和51bp),GG(181bp和51bp)。
　　3.在基因型和等位基因频变方面,胰腺癌组对比与非肿瘤组,呈现出XRCC1基因 cDNA1471位点A向G突变;X R C C1基因cDNA1686位点上G向C的变异。
　　通过分析基因频变和基因分型,我们发现:胰腺癌组对比非癌组,等位基因G和等位基因C分别在X R C C1基因cDNA1471位点和cDNA1686位点上占据主导地位。在cDNA1471位点(胰腺癌组:G,71.49%,A,28.51%;非癌组:G,62.00%,A,38.00%;x2=13.7203,P=0.0002);在cDNA1686位点(胰腺癌组:C,72.87%,G,27.13%;非癌组:C,65.14%,G,34.86%,x2=9.4227,P=0.0021)。同时,对比两组基因分型数据显示:胰腺癌组与非癌组变化不一样,有显著统计学差异,cDNA1471位点(X2=12.8496,P=0.0016); cDNA1686位点(x2=8.8232,P=0.0002)。
　　4.通过分析显示:人类X R C C1基因cDNA1471位点和cDNA1686位点碱基突变,可能和胰腺癌的发生风险性存在相互关联的现象。
　　对于X R C C1基因cDNA1471位点,等位基因A向G的突变,会增加患胰腺癌的风险性。纯合子比对(AAvs.GG: OR=0.43,95%CI(0.26-0.70),七=11.91,P=0.001),杂合子比较(GA vs.GG提示:OR=0.72,95%CI(0.52-1.00),七=4.01,P=0.045),显性模型比较(AA/GA vs.GG提示:OR=0.63,95%CI(0.47-0.86)，=8.65,P=0.003),隐性模型比较(AAvs.GA/GG提示:OR=0.50,95%CI(0.31-0.79),x2=8.82,P=0.003)和等位基因对比(A vs.G提示 OR=0.65,95%CI(0.52-0.82),七=13.71,P<0.001)。同时,在X R C C1基因cDN1686位点,等位基因G向C的突变,导致胰腺癌发病的风险性提升。纯合子比较(GG vs.CC: OR=0.48,95%CI(0.29-0.81),x2=7.98,P=0.005),优势模型(GG/GC vs.CC: OR=0.69,95%CI(0.51-0.93),七=5.99,P=0.014),隐性模型(GG vs.GC/CC: OR=0.55,95%CI(0.34-0.89),七=5.98,P=0.014),而等位基因对比(Gvs.C: OR=0.70,95%CI(0.55-0.88),x2=9.42,P=0.002)。
　　5.总共有711名参研对象被纳入人类OGG1基因2个单核苷酸多态性位点与胰腺癌风险性关联的研究中,包括347例胰腺癌患者和364例非癌对照者。
　　胰腺癌组与对照组(性别,年龄,吸烟情况,饮酒,体重指数,糖尿病及胰腺癌家族史)的分类研究中,采用卡方检验,显示无明显统计学差异(P值均>0.05),提示胰腺癌组和非癌对照组基因分型无显著偏离,遵守Hardy-Weinberg平衡。
　　6.验证了人类OGG1基因2个单核苷酸多态性位点中有基因突变的位点存在。
　　人类O G G1基因cDNA269位点上等位基因C与A之间的变异;人类O G G1基因cDNA269位点上cDNA627位点上等位基因T与C之间的变异。采用CRS-PCR方法进行基因分型,发现cDNA269位点上存在非同义突变,其中人类O G G1基因2号外显子上A到C的突变,使得最后翻译的氨基酸由脯氨酸变为谷氨酰胺(Pro90Gln, reference sequences GenBank ID nos. NG—012106.1, NM—002542.5and NP—002533.1)。HpaII限制性内切酶将这种遗传变异的PCR扩增产物,分成3种基因型:CC(192 bp、18 bp), CA(210 bp、192 bp、18bp),AA(210bp)。而 cDNA627位点突变是同义突变,它在人类OGG1基因的4号外显子中造成C到 T的突变(丝氨酸209丝氨酸)。通过PCR-RFLP方法进行基因分型检测。这种遗传变异的P C R扩增产物用限制性内切酶HhaI酶切,得到3种基因型:TT(243 bp), TC(243 bp、164 bp、79 bp), CC(164 bp、79 bp)。
　　7.对比胰腺癌组与非肿瘤组,在基因型和等位基因频变方面显示:人类 OGG1
　　基因cDNA263位点等位基因A向G突变;人类O G G1基因cDNA627位点上C向G的变异。
　　实验数据提示:胰腺癌组对比非癌组,占据主导地位的等位基因,分别是人类O G G1基因 cDNA263位点上的等位基因C和cDNA627位点上的等位基因T。在cDNA263位点(胰腺癌组:C,72.77%; A,27.23%;非癌组:C,64.70%; A,35.30%; X2=10.7453,P=0.0010);在cDNA627位点(胰腺癌组:T,72.91%; C,27.09%);非癌组:T,66.07%; C,33.93%; x2=7.8271,P=0.0051)。此外,对比两组基因分型数据,胰腺癌组与非癌组变化不一致,有显著统计学差异,cDNA263位点(x2=10.7380, P=0.0047); cDNA627位点(x2=7.3475, P=0.0254)。
　　8.通过分析显示:人类O G G1基因cDNA263位点和cDNA627位点单核苷酸多态性与胰腺癌发生的风险性存在一定的关联。
　　对于人类OGG1基因cDNA263位点,等位基因A向C的突变,胰腺癌发生的概率会增加。纯合子比对(AAvs.CC, OR=0.44,95% CI(0.27-0.73),Z=3.18, P=0.001);杂合子比较(AA/CA vs. CC,OR=0.69,95%CI(0.52-0.93),Z=2.42,P=0.015);显性模型(AA/CAvs. CC,OR=0.69,95% CI(0.52-0.93), Z=2.42, P=0.015);隐性模型(AA vs. CA/CC, OR=0.49,95% CI(0.31-0.80),Z=2.88, P=0.004);等位基因对比(Avs. C, OR=0.69,95% CI(0.55-0.86), Z=3.27, P=0.001)。同时,人类OGG1基因cDN1686位点上,等位基因C向T的突变,使得胰腺癌发病的风险性上升。纯合子比较(CC vs. TT, OR=0.57,95% CI(0.35-0.94), Z=2.19, P=0.028;杂合子对比(TC vs. TT, OR=0.71,95% CI(0.52-0.97), Z=2.13,P=0.033);显性模型对比(GG vs. GC/CC,OR=0.55,95%CI(0.34-0.89),七=5.98,P=0.014);隐性模型对比(CC vs. TC/TT,OR=0.67,95%CI(0.42-1.07),Z=1.66 P=0.096);等位基因对比(C vs.T,OR=0.72,95% CI(0.58-0.91), Z=2.79, P=0.005)。
　　结论:
　　1.在人OGG1基因中,c.269 C>A的等位基因A和c.627 T> C的等位基因C是预防胰腺癌的保护基因(c.269C>A中 A vs.C, OR=0.69,95% CI(0.55-0.86),P<0.001; c.627T>C, C vs T, OR=0.72,95% CI(0.58-0.91), P=0.005)。
　　2.本研究的结果表明,在西南地区汉族人口中,人OGG1基因c.269C> A和c.627 T> C的单核苷酸多态性可能与胰腺癌的易感性成正有关。
　　3.在XRCC1基因中,等位基因A出现于c.1471 G> A位点以及等位基因G出现于c.1686 C> G位点,有助于降低胰腺癌的风险(c.1471G>A中A vs. G; OR=0.65,95% CI(0.52-0.82), x2=13.71, P<0.001; c.1686C>G中 GvsC,0R=0.70,95% CI(0.55-0.88), x2=9.42,P=0.002)。
　　4.我们的研究结果表明:在中国西南地区汉族人群中,X R C C1基因 c.1471G>A及c.1686 C> G的单核苷酸多态性与胰腺癌发病风险性成正相关。

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缩略语表

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DNA修复基因(XRCC1、OGG1)单核苷酸多态性与胰腺癌易感性的关联研究

第一章 前言

第二章 胰腺癌部分发病危险因素的分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4小结

第三章 XRCC1基因单核苷酸多态性与胰腺癌易感性的关联性研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 OGG1基因单核苷酸多态性与胰腺癌易感性的关联性研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

参考文献

文献综述一

文献综述二

攻读博士期间发表的论文

致谢