胆固醇转运蛋白NPC1L1对结直肠癌细胞增殖的调控作用及分子机制研究

摘要

背景：
　　代谢异常是恶性肿瘤的重要特征。代谢改变不仅为肿瘤细胞输送维持恶性生物学特性所需的营养物质和能量，也向其源源不断传递不受限制的生长信号。对于肿瘤代谢研究的关注始于二十世纪初Warburg效应的发现:正常细胞主要通过氧化磷酸化和三羧酸循环分解葡萄糖获得能量，而肿瘤细胞即使在供氧充足的情况下也更倾向于利用糖酵解分解葡萄糖，伴随产生大量的乳酸。经过近一个世纪对肿瘤代谢的探索，以Warburg效应为代表的代谢重编程研究早已经突破了糖酵解和三羧酸循环的局限，许多代谢通路包括脂肪酸代谢，谷氨酰胺代谢，丝氨酸代谢和胆固醇代谢等，都被发现在肿瘤细胞中有代谢改变的现象。其中胆固醇代谢异常在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到重视，但对其分子机制的研究还比较缺乏。
　　胆固醇在人体中发挥非常重要的生理功能，它不直接提供能量，却是合成胆汁、维生素D和甾体激素的必须原料，更重要的是它是构成细胞膜的主要成分。细胞膜表面由丰富胆固醇和鞘磷脂组成的微结构域脂筏作为功能平台聚集各种信号分子，直接参与并调控了许多重要的信号转导通路。正常生理状态下的胆固醇代谢包括外源和血浆胆固醇的吸收摄取、内源胆固醇合成以及胆固醇的流出三个方面，共同维持细胞及人体内的胆固醇动态平衡。
　　尼曼-匹克C1型类似蛋白(Niemann-Pick C1-like1，NPC1L1)是外源胆固醇转运的关键蛋白，是临床上广泛应用的降脂药物依折麦布的作用靶点。2008年，一项大型临床研究报告显示，服用含有依折麦布药物的患者肿瘤发生率明显高于安慰剂组(105vs.70，P=0.01)。尽管人们对于这一结论尚存在争议，但很快动物实验中也发现类似的现象:在致癌剂诱导的乳腺癌动物模型中依折麦布能够促进肿瘤的恶性增殖，然而机制尚不清楚。基于多种肿瘤中发现的胆固醇代谢异常现象，NPC1L1在胆固醇代谢中的重要作用以及NPC1L1靶点药物依折麦布的致癌争议，我们推测胆固醇转运蛋白NPC1L1可能在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，而脂质代谢包括胆固醇代谢的异常与其发生发展密切相关，我们对175例临床结直肠癌患者标本的检测发现，NPC1L1在结直肠癌组织中的表达明显低于对应癌旁组织，其表达与临床预后呈显著负相关。因此我们进一步推测，NPC1L1的低表达对于结直肠癌的发生和发展可能具有重要调控作用。
　　目的:
　　1.研究NPC1L1在人结肠癌组织中的表达及临床意义。
　　2.研究NPC1L1对结直肠癌细胞恶性增殖能力的作用和分子机制。
　　材料与方法:
　　1.结直肠癌组织芯片的免疫组织化学染色用于检测NPC1L1在结直肠癌及癌旁组织的表达及临床相关性。
　　2.NPC1L1基因敲除的APCmin/+肿瘤小鼠模型用于研究NPC1L1表达缺失对肠道肿瘤发生发展的影响。
　　3.CRISPR/Cas9技术构建NPC1L1基因敲除的人结直肠癌细胞系用于体外增殖能力检测及机制研究。
　　4.基于慢病毒载体建立NPC1L1敲减及过表达的人结直肠癌细胞系用于体外增殖能力检测及机制研究。
　　结果:
　　1.人结直肠组织中表达NPC1L1，与正常组织相比，人结直肠癌癌组织低表达。NPC1L1在癌组织中的低表达与临床预后不良密切相关。
　　2.NPC1L1敲除的APCmin/+肿瘤小鼠模型肠道肿瘤数量和肿瘤大小明显增加，肿瘤负荷显著加重。
　　3.CRISPR/Cas9技术构建NPC1L1基因敲除的人结直肠癌细胞系，基于慢病毒载体构建NPC1L1敲减和过表达的人结直肠癌细胞系，使用克隆形成、CCK-8实验和裸鼠移植瘤实验证实NPC1L1表达具有调控肿瘤细胞恶性增殖的能力。
　　4.NPC1L1敲除降低结直肠癌细胞细胞内胆固醇水平，同时抑制LXRα信号通路和激活SREBP2信号通路。使用特异性药物激活LXRα或抑制SREBP2对NPC1L1敲除引起的核因子kappa B(Nuclear Factor Kappa B，NF-κB)信号通路和增殖表型没有明显影响。使用环糊精和环糊精/胆固醇调控细胞内胆固醇水平对NF-κB信号通路也没有明显影响。此外，回复表达野生型NPC1L1和L216A突变的NPC1L1对NF-κB信号通路和增殖表型具有相同的逆转作用。
　　结论:
　　1.NPC1L1在人结直肠癌组织中低表达，其表达缺失与临床预后不良相关。
　　2.NPC1L1调控人结直肠癌细胞的恶性增殖。
　　3.NPC1L1通过调控NF-κB信号通路作用于肿瘤细胞增殖表型。
　　4.NPC1L1通过非胆固醇依赖方式调控NF-κB信号通路和肿瘤细胞增殖。

目录

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摘要

前言

第一章 结直肠癌组织和细胞中NPC1L1的表达及临床意义

1．1 材料与方法

1．2 实验结果

1．3 讨论

第二章 NPCILl敲除对APCmin／+小鼠肿瘤恶性增殖的作用

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 干扰NPC1L1表达对结直肠癌细胞恶性增殖的作用

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

第四章 NPC1L1调控NF-κB信号通路并作用于结直肠癌细胞恶性增殖的机制研究

4．1 材料与方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

第五章 NPC1L1通过非胆固醇依赖功能调控NFκB信号通路及结直肠癌细胞增殖的研究

5．1 材料与方法

5．2 实验结果

5．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 胆固醇代谢与肿瘤

攻读博士期间发表的文章

致谢