BMPR1A介导的信号通路对成骨细胞数量及终末分化的作用

摘要

骨形态发生蛋白(BMPs)由Urist发现并命名，被认为是在肌肉等软组织中诱导异位骨化的因子，随后BMPs被证实也参与机体的多种器官组织的发育和形成，在机体中的多种细胞中发挥广泛的生物作用。BMPs通过激活Smad依赖性通路和非Smad依赖性通路来影响基因表达。近年来关于不同物种、不同细胞、不同时间干预BMP信号通路的研究发现均可以导致骨量的不同变化，但具体机制尚不明了，且存在很大的争议。目前的研究较多关注的是骨量的增多与减少，却很少涉及骨的质量问题。
　　骨发生蛋白1A型受体-BMPR1A（也叫做Alk-3、Brk-1）与BMPs和BMPRⅡ同属于TGF-β（转化生长因子β）家族，BMPR1A是BMP2，BMP4的强有力的受体，直接影响BMP2，BMP4在通路中的作用。BMP2是骨诱导因子，可以诱导间充质细胞增生、分化为成骨细胞或软骨细胞，在骨的发生、诱导、修复等方面发挥关键作用。BMP2可直接或间接参与破骨细胞的形成、分化、成熟及活性;BMP4是一个关键的成骨细胞因子，参与异位骨化的早期病变，对Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(Ocn)的表达有刺激作用;BMP4可诱导间充质干细胞分化形成软骨细胞，并促进软骨细胞的成熟。
　　成骨细胞由骨髓间充质干细胞分化而来，主要参与骨的形成和骨损伤的修复过程。活跃的成骨细胞位于骨形成表面。分化成熟的成骨细胞合成并分泌胞外基质蛋白，包括各种胶原和非胶原蛋白、形成类骨质及启动骨的形成。成年机体的骨形成，受到严格的调控以维持骨的稳态。成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡几个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。
　　目的：
　　鉴于成骨细胞数量及功能在骨稳态维持中的重要作用，以及BMPR1A介导的BMP信号通路在骨发育和骨形成中的重要影响，在本实验中，我们拟观察:1.观察成骨细胞其可能的机制;2.观测BMPR1A介导的BMP通路对成骨细胞终末分化的影响，小鼠骨矿化、胶原合成等能力的影响，是否导致小鼠骨质量的变化，并探讨其中可能的作用机制。
　　方法：
　　第一部分:成骨细胞中敲除BMPR1A在调控成骨细胞数量中的作用
　　1.建立成骨细胞特异性敲除BMPR1A小鼠模型，并观察小鼠大体形态，测量体重和下肢骨长度;
　　2.利用X线摄片、microCT扫描、H&E染色等观察小鼠骨量变化及骨组织结构变化;
　　3.TRAP染色观察破骨细胞数量及功能，BrdU免疫组织化学检测成骨细胞增殖情况，TUNEL法观察成骨细胞和生长板肥大层细胞凋亡情况，
　　第二部分:成骨细胞中敲除BMPR1A对成骨细胞终末分化的调节作用
　　1.对小鼠下肢骨标本进行半脱钙处理，进行Von Kossa矿化结节染色、Masson染色、天狼星红染色-偏振光显微镜等观察矿化情况及胶原含量的变化，
　　2.利用免疫组织化学染色检测成骨细胞标志物OSX、Runx2、成骨矿化抑制因子OPN、FGF23的表达;
　　3.测定血清中碱性磷酸酶及钙、磷含量，观察小鼠钙磷代谢是否正常;
　　4.小鼠长骨原代成骨细胞及骨细胞体外分离培养，并进行成骨诱导，茜素红染色观察矿化水平，流式细胞仪技术检测细胞周期变化。提取细胞总RNA，实时定量PCR检测骨形成与骨吸收相关基因BMPR1A、β-catenin、RANKL、OPG的表达。
　　5.对小鼠下肢骨标本，及牙齿组织标本进行处理后，扫描电镜观察细胞形态及骨量变化。
　　结果：
　　一、成骨细胞中敲除BMPR1A小鼠的松质骨骨量增加明显，主要由于成骨功能增强，破骨功能减弱导致。
　　1.通过对比3.2Cre与DMP1Cre的表达位置我们可以明确3.2Cre在成骨细胞中特异性表达，成骨细胞中敲除BMPR1A动物模型成立。
　　2.成骨细胞中敲除BMPR1A(cKO)小鼠与对照组相比外观形态上无明显差异，但其体型稍小，未见明显的发育迟缓征象，但cko小鼠体重减轻，且下肢骨长度与对照小鼠对比有所缩短。
　　3.BMPR1A敲除小鼠松质骨骨量增加明显。小鼠下肢骨的X线检测发现，cKO小鼠长骨干骺端的放射密度较对照小鼠明显增高。microCT结果提示在横截面上，小鼠胫骨从松质骨至皮质骨cKO小鼠骨量均明显增加，而胫骨组织切片的HE染色可见，cKO小鼠的松质骨骨量明显增多，这与正常的长骨结构差异显著。
　　4.cKO小鼠成骨细胞增殖及活性显著增加。其成骨细胞标志RunX2、Osterix表达升高，BrdU检测成骨细胞增殖活动加强，TUNEL凋亡检测成骨细胞凋亡减弱，
　　5.cKO小鼠破骨细胞活动减弱。cKO小鼠的骨组织中破骨细胞的数量减少，破骨细胞标志RANKL表达水平减弱，体外分离培养骨细胞中RANKL/OPG基因表达比值有所降低。
　　二、成骨细胞中敲除BMPR1A小鼠成骨细胞终末分化受阻。
　　1.在体与离体矿化染色实验结果提示cKO小鼠骨组织矿化能力减弱，扫描电镜结果提示cKO小鼠的骨细胞之间失去了正常细胞间的连接突触，无细胞与细胞间的紧密联系，骨皮质变薄，且孔隙增多，失去了相互之间致密的连接。
　　2.BMPR1A敲除小鼠骨胶原合成能力减弱，Masson染色发现cKO小鼠长骨的胶原成分含量与对照小鼠相比减弱明显，从胶原成分分析，cKO小鼠长骨中所含胶原大多为Ⅲ型胶原，Ⅰ型胶原含量很少，而对照组小鼠则是Ⅰ型胶原为主，Ⅲ型胶原较少;从胶原的排列上来看，cKO小鼠的胶原排列与对照组相比显得杂乱无章，失去了正常的纵向规律的排列。
　　3.免疫组织化学染色结果提示cKO小鼠骨组织中骨矿化抑制因子OPN和FGF23的表达增强，血清中钙水平与对照小鼠相比升高，而磷水平相对下降，cKO小鼠成骨细胞在细胞周期检测中，有更多的细胞停留在了G期。
　　结论：
　　一、成骨细胞中敲除BMPR1A后，小鼠的成骨细胞数量明显增加，破骨细胞数量微量减少，小鼠骨量增加明显。成骨细胞中BMPR1A信号通路对维持正常骨量有重要调控作用，可以通过调控成骨细胞数量以实现。
　　二、成骨细胞中敲除BMPR1A后，小鼠的成骨细胞终末分化受阻，会导致成骨细胞矿化减少、胶原合成能力减弱、骨质量下降，成骨细胞矿化能力的缺陷及骨基质成分的表达减少可能造成了小鼠骨质量下降和骨机械性能的破坏。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 成骨细胞中敲除BMPR1A在调控成骨细胞数量中的作用

2．1 方法与材料

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 成骨细胞中敲除BMPR1A对成骨细胞终末分化的调节作用

3．1 方法与材料

3．2 结果

3．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 骨形态发生蛋白1A型受体与骨代谢的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢