罗非鱼肌肉蛋白热变性聚集行为及其抑制

摘要

热处理是食品加工中必不可少的环节，也是一种常见的食品蛋白质变性方法。本研究以罗非鱼为原料，提取水溶性和盐溶性蛋白以及肌球蛋白，进行水浴热处理，试验不同pH值条件下，热处理温度和时间对体系浊度、溶解度、总巯基含量、表面疏水性、色氨酸荧光、SDS-PAGE等的影响，分析蛋白质分子的热变性动力学，探讨热变性聚集的机理;试验SDS及SDS-β-CD的添加对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果，探讨人工分子伴侣介导液相体系中肌球蛋白热稳定性的改善，将蛋白质的变性聚集控制在一个可接受的范围内，以期对罗非鱼资源的有效利用和加工开发相关产品提供理论依据。主要结果如下:
　　(1)水溶性和盐溶性蛋白热变性率(30～90℃，0～30min)试验及热变性动力学分析显示，水溶性蛋白在试验各温度下的D值和Z值均低于盐溶性蛋白，两种提取蛋白的热变性反应级数分别为1.2和1.1;根据阿列纽斯方程，得出两种提取蛋白的热变性反应活化能Ea分别为59.97和9.81kJ/mol。相同热处理条件下，水溶性蛋白体系的浊度、聚集速率明显大于盐溶性蛋白;热处理后可溶性蛋白进行还原和非还原电泳分析显示，随着热处理时间的延长，两种提取蛋白的电泳条带逐渐变浅。综合分析，水溶性蛋白的耐热性比盐溶性蛋白差。
　　(2)提取罗非鱼肌动球蛋白并对其进行热升温处理(30～90℃，1℃/min)。动态流变学研究显示，肌动球蛋白热诱导凝胶是一个不稳定的动态流变变化过程，随着热处理温度的升高，体系的弹性模量(G')在30℃之前缓慢升高，46℃时达到最低点，80℃之后迅速增加;热处理体系的浊度呈现S型增加，表面疏水性逐渐增加，且在40～60℃之间变化明显(p＜0.05);溶解度、总巯基含量逐渐下降，在30～50℃之间差异显著(p＜0.05);色氨酸荧光值在60℃之后下降迅速。SDS-PAGE电泳表明，在加热过程(＞45℃)中产生了新的二硫交联，说明罗非鱼肌动球蛋白在加热过程中构象发生了变化，分子聚集导致了肌动球蛋白的热变性。结合肌动球蛋白在45℃时聚集速率最大，储能模量G在46℃时达到最小值，表明罗非鱼肌动球蛋白的变性温度可能在46℃。
　　(3)提取肌球蛋白，固定蛋白浓度2mg/mL，试验不同pH条件(pH2.0、5.0、6.0、7.0和11.0)下热升温处理(30～90℃，1℃/min)对肌球蛋白热变性聚集的影响。比较而言，在碱性条件下，热升温处理对肌球蛋白体系浊度和溶解度影响不明显(p＞0.05);在中性条件下，随着热处理温度的升高，体系的浊度增大，溶解下降，蛋白质分子结构发生了较大的改变;以Ca2+-ATP酶活性变化为基础，分析中性条件下肌球蛋白的热力学表观活化能Ea为166.51kJ/mol;在酸性条件下，肌球蛋白的稳定性较差，热变性聚集强度pH6.0＜pH2.0＜pH5.0;在pH6.0条件下，热处理温度≥60℃时，蛋白质分子结构发生明显变化，但没有形成明显的聚集体，粒径变化不明显(p＞0.05);以热变性率为基础进行热变性动力学分析，pH2.0和pH5.5条件下的肌球蛋白热反应级数分别为1.3、1.4，热变性反应活化能Ea分别为102.92、286.67kJ/mol。
　　(4)进一步以浊度和溶解度的变化为指标，试验SDS及SDS和β-CD的添加对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果。单因素影响分析表明，在试验范围内，在pH6.0，SDS添加量5mmol/L，初始蛋白浓度2mg/mL条件下，50℃热处理后30min添加β-CD（SDS与β-CD的比例为1∶2），可以有效抑制肌球蛋白的热变性聚集。在此条件下进行热聚集变性抑制机理分析显示，添加SDS和SDS-β-CD均能有效抑制热处理(30～80℃，30min)对肌球蛋白溶解度和浊度的影响(p＞0.05)，抑制热处理对蛋白分子巯基和色氨酸残基的破坏作用，降低蛋白质分子间相互作用，由此抑制肌球蛋白热处理过程中的变性聚集，改善体系的热稳定性。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 罗非鱼肌肉蛋白组成

1．3 蛋白质热变性聚集研究进展

1．3．1 蛋白质热变性动力学的研究进展

1．3．2 蛋白质热变性聚集的影响因素

1．3．3 蛋白质热变性聚集机理

1．4 蛋白质热变性聚集的抑制

1．5 本研究的立题依据和研究内容

1．5．1 研究目的及意义

1．5．2 主要研究内容

2 罗非鱼肉水溶性蛋白和盐溶性蛋白热变性聚集研究

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 水溶性蛋白和盐溶性蛋白的提取

2．3．2 两种提取蛋白的热处理

2．3．3 浊度的测定

2．3．4 变性率的测定

2．3．5 热变性动力学描述

2．3．6 电泳分析

2．3．7 统计分析

2．4 结果与分析

2．4．1 罗非鱼肉水溶性蛋白和盐溶性蛋白热变性动力学分析

2．4．2 热处理对水溶性蛋白和盐溶性蛋白体系浊度的影响

2．4．3 热处理罗非鱼肉水溶性蛋白和盐溶性蛋白的电泳分析

2．5 本章小结

3 罗非鱼肌动球蛋白热变性聚集的研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 肌动球蛋白的提取

3．3．2 流变

3．3．3 肌动球蛋白的热处理

3．3．4 浊度的测定

3．3．5 溶解度的测定

3．3．6 表面疏水性的测定

3．3．7 总巯基含量的测定

3．3．8 色氨酸荧光的测定

3．3．9 紫外光谱扫描的测定

3．3．10 SDS-PAGE分析

3．3．11 数据处理与统计分析

3．4 结果与分析

3．4．1 罗非鱼肌动球蛋白热诱导流变特性的研究

3．4．2 升温处理过程中罗非鱼肌动球蛋白体系浊度的变化

3．4．3 升温处理过程中罗非鱼肌动球蛋白溶解性的变化

3．4．4 升温处理过程中罗非鱼肌动球蛋白表面疏水性的变化

3．4．5 升温处理过程中罗非鱼肌动球蛋白总巯基含量的变化

3．4．6 升温处理过程中罗非鱼肌动球蛋白色氨酸荧光光谱的变化

3．4．7 升温过程中罗非鱼肌动球蛋白紫外光谱的影响

3．4．8 升温过程中罗非鱼肌动球蛋白的电泳分析

3．5 本章小结

4 罗非鱼肌球蛋白热变性聚集研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．1 罗非鱼肌球蛋白的提取及纯度分析

4．3．2 各pH下肌球蛋白溶液的制备及热处理

4．3．3 浊度的测定

4．3．4 溶解度的测定

4．3．5 粒径测定

4．3．6 Ca2+-ATP酶活的测定及变性动力学分析

4．3．7 表面疏水性的测定

4．3．8 总巯基含量的测定

4．3．9 SDS-PAGE分析

4．3．10 色氨酸荧光的测定

4．3．11 统计分析

4．4 结果与分析

4．4．1 升温处理对肌球蛋白热变性聚集的影响

4．4．2 中性条件下肌球蛋白热变性聚集行为分析

4．4．3 酸性条件下时肌球蛋白热变性聚集行为分析

4．5 本章小结

5 人工分子伴侣抑制肌球蛋白热变性聚集的研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料与试剂

5．2．2 仪器与设备

5．3 实验方法

5．3．1 罗非鱼肌球蛋白的提取

5．3．2 罗非鱼肌球蛋白的热处理

5．3．3 浊度的测定

5．3．4 溶解度的测定

5．3．5 总巯基含量的测定

5．3．6 SDS-PAGE分析

5．3．7 色氨酸荧光的测定

5．3．8 统计分析

5．4 结果与分析

5．4．1 SDS抑制肌球蛋白热变性聚集的影响因素分析

5．4．2 SDS抑制肌球蛋白热聚集的机理研究

5．5 本章小结

6 结论与展望

6．1 研究结论

6．2 研究创新点

6．3 研究展望

参考文献

致谢

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