蛋白稳定剂对罗非鱼肌球蛋白热变性聚集的抑制及机理

摘要

为了更好地了解和控制水产蛋白的热聚集沉淀，提高水产蛋白的热稳定性，本研究以罗非鱼白肉为原料，提取肌球蛋白，固定蛋白浓度2.0 mg/mL，进行水浴热处理，试验pH值、离子强度、热处理温度和时间对罗非鱼肌球蛋白溶解度及结构的影响，在此基础上添加蛋白稳定剂，试验添加剂的种类和浓度对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果，分析了 SDS及精氨酸对肌球蛋白热变性聚集的抑制机理，研究结果为提高水产蛋白的热稳定性，合理开发水产蛋白资源提供一定的理论基础。主要结果如下：
　　1、pH值（5.5-8.0）和盐浓度（1-600 mmol/L KCl）对罗非鱼肌球蛋白热稳定性的影响明显，在低盐浓度或酸性pH条件下肌球蛋白的热稳定性差，而在高盐浓度或碱性条件下稳定性较好。在热升温处理（40-90℃，1℃/min）过程中，酸性 pH条件下，肌球蛋白分子展开，表面疏水性增强，体系浊度增加，且在50-70℃范围内变化最明显，溶解度、α-螺旋含量、总巯基含量下降，聚集体粒径增大，肌球蛋白分子明显降解；中性条件下，热处理后肌球蛋白溶解度显著下降，分子二级和三级结构的变化较酸性条件下的变化程度要小；而在pH8.0条件下，热处理对肌球蛋白体系浊度、溶解度及粒径的影响不明显，肌球蛋白分子重链发生交联形成可溶性聚集体，总巯基含量下降；此外，低盐浓度（1-150 mmol/LKCl）条件下，肌球蛋白呈粗丝状，溶解度较低，热升温处理过程中体系浊度增大，溶解度、α-螺旋含量显著减小；而高盐浓度（300-600 mmol/L KCl）条件下，肌球蛋白分子以单体状态，溶解度较大，表面疏水性及α-螺旋含量较高，热处理使得肌球蛋白溶解度及结构发生明显的变化，但较低离子强度下程度变化要小。
　　2、保温热处理（30-80℃，5-60 min）对肌球蛋白溶解度及分子结构的影响与热处理温度和时间有关。在30-40℃条件下，随着热处理时间的延长，肌球蛋白体系浊度和溶解度变化不明显，而表面疏水性明显增大，α-螺旋含量减少；在50-80℃条件下，热处理5 min后，肌球蛋白即发生明显的变性聚集，溶液出现絮凝沉淀现象，表面疏水性增大，同时溶解度和α-螺旋含量降低，而之后随着保温时间的延长，蛋白分子溶解度和结构变化不明显。
　　3、为了进一步试验体系热稳定性的改善，选取三种代表性的离子强度（1、150、600 mmol/L KCl），分别添加蔗糖、精氨酸（L-Arg）、十二烷基硫酸钠（SDS）和卡拉胶，试验肌球蛋白热处理（50℃，30 min）过程中浊度和溶解度的变化，分析蛋白稳定剂对肌球蛋白热聚集的抑制效果。比较而言，在1 mmol/L和150mmol/LKCl溶液中，随着SDS和L-Arg添加量（0-3 mmo/L）的增加，热处理肌球蛋白体系的浊度降低，溶解度增大，热聚集抑制效果明显，之后随着添加量的增加（3-10 mmo/L），浊度和溶解度变化不明显；而蔗糖和卡拉胶的添加对肌球蛋白热处理过程中溶解度和浊度的影响不大，抑制效果不明显；在600mmol/L KCl溶液中，L-Arg的添加能较好抑制体系的热聚集，而蔗糖、SDS和卡拉胶的添加导致体系热聚集更加明显。因此，选择SDS和L-Arg进一步试验。
　　4、添加3 mmo/L的SDS，试验不同pH值（6.0、7.0和8.0）和离子强度（1-150 mmol/L KCl）条件下，热处理（50℃，30 min）对肌球蛋白体系浊度、溶解度及分子结构的影响，分析SDS对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果及其机理。在实验范围内，在酸性和中性条件下，热处理导致肌球蛋白明显聚集沉淀，添加 SDS后热处理，体系浊度和聚集体粒度均显著降低，表面疏水性和溶解度显著升高，且α-螺旋含量也随之增大；在碱性条件下，添加SDS后热处理，体系澄清透明（1-100 mmol/L KCl），溶解度明显增加，热变性聚集的抑制效果明显。初步分析其抑制机理可能与SDS和蛋白质分子间的静电作用和疏水作用有关。
　　5、添加3 mmo/L的L-Arg，试验不同pH值（6.0、7.0和8.0）和离子强度（1-600 mmol/L KCl）条件下，热处理（50℃，30 min）对肌球蛋白体系浊度、溶解度及分子结构的影响。结果显示，L-Ar g的添加能明显提高肌球蛋白在低离子条件下的溶解度，抑制蛋白分子间的聚集，降低溶液体系浊度，减小聚集体的粒径；与直接加热组比较，经精氨酸增溶处理后加热，肌球蛋白体系浊度减小，溶解度增大，抑制热聚集效果明显，且在酸性及低离子强度条件下抑制效果更显著；同时，精氨酸的加入使得肌球蛋白表面疏水性显著增大，α-螺旋含量呈下降趋势。初步分析其抑制效果可能与精氨酸的增溶效应及其与肌球蛋白分子的静电相互作用有关，相关机理还有待进一步研究。

目录

声明

1 绪论

1. 1 肌球蛋白

1. 2 肌球蛋白热聚集行为的研究进展

1. 3 蛋白质热变性聚集抑制的研究进展

1. 4 本研究的立体依据及研究内容

2 罗非鱼肌球蛋白的热变性聚集的影响因子

2. 1 引言

2. 2 材料与设备

2. 3 实验方法

2. 4 结果与分析

2. 5 本章小结

34种蛋白稳定剂对罗非鱼肌球蛋白热变性聚集的抑制效果

3. 1 引言

3. 2 材料与设备

3. 3 实验方法

3. 4 结果与分析

3. 5 本章小结

4 SDS对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果及机理

4. 1 引言

4. 2 材料与设备

4. 3 实验方法

4. 4 结果与分析

4. 5 本章小结

5 精氨酸对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果及机理

5. 1 引言

5. 2 材料与设备

5. 3 实验方法

5. 4 结果与分析

5. 5 本章小结

6 结论与展望

6. 1 研究结论

6. 2 研究创新点

6. 3 研究展望

参考文献

致谢

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