溶藻弧菌双组份调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其交叉免疫保护性研究

摘要

双组分调控系统(Two-component Regulatory System)在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用。本研究克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901株组氨酸激酶KdpD和反应调控因子KdpE的全长基因，并对其进行生物信息学分析。序列分析结果显示，kdpD（GenBank登录号:KJ544668）全长1374bp，共编码457个氨基酸;kdpE（GenBank登录号:KJ476728）全长732bp，编码243个氨基酸。构建KdpD和KdpE的系统进化树，结果显示溶藻弧菌KdpD和KdpE与坎氏弧菌（V.campbellii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）相应蛋白有较近亲缘关系。利用SWISS-MODEL软件，对KdpD/KdpE中两个相对保守的功能域HATPase_c和REC进行同源建模。
　　本研究采用Overlap PCR和同源重组技术，结合正负向筛选，构建三株无标记基因框内敲除突变株:△kdpDE、△kdpD和△kdpE，比较突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。结果显示双组分调控系统KdpDE对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显，但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性实验结果显示，突变株△kdpDE的毒力下降了78.5倍，突变株△kdpD的毒力下降8.84倍，△kdpE的毒力下降19.6倍，这证实减毒株构建成功。
　　本研究分析了突变株在水体中的存活情况，菌体浓度在106CFU/mL条件下，14d后水体基本检测不到突变株;最后考察了其在鱼体内的存活情况，注射免疫7d后，鱼体内不能检测到该菌，表明该疫苗候选株是比较安全的。
　　以突变株△kdpDE，△kdpD和△kdpE为抗原，分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼，免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒，评估该突变株及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明，免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染，其中注射组的免疫保护率分别为73.3％、76.7％和83.3％，浸泡组的免疫保护率为60.0％、63.3％和66.7％;同时，该突变株能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应，其中注射组的免疫保护率为55.2％～65.5％，浸泡组为48.8％～55.2％。以上结果表明，kdpDE基因敲除突变株可能是有效抵抗溶藻弧菌感染的减毒活疫苗候选株。

目录

声明

摘要

英文缩略词

1 文献综述

1．1 弧菌及弧菌病

1．1．1 常见弧菌病

1．1．2 溶藻弧菌

1．1．4 哈维氏弧菌

1．2 双组分调控系统(Two component regulatory systems，TCRS)

1．2．1 双组分调控系统KdpDE

1．3 疫苗

1．3．1 灭活疫苗

1．3．2 减毒活疫苗

1．3．3 亚单位疫苗

1．3．4 核酸疫苗

1．3．5 合成肽疫苗

1．3．6 鱼类疫苗接种方法

1．4 斑马鱼在鱼类疫苗研究中的应用

1．5 技术路线

1．6 研究目的以及意义

2 溶藻弧菌kdpD和kdpE基因的克隆及序列分析

2．1 材料

2．1．1 菌株和载体

2．1．2 主要试剂及载体

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 V．alginolyticus HY9901株细菌总DNA的提取

2．2．2 kdpD和kdpE基因的克隆

2．2．3 目的片段的连接和测序

2．2．4 生物信息学分析

2．3 结果

2．3．1 kdpD和kdpE基因的全长克隆

2．3．2 理化性质

2．3．3 序列分析

2．3．4 进化分析

2．3．5 功能结构域和二级结构的预测

2．3．6 保守功能域三维结构

2．4 讨论

3 突变株△kdpDE、△kdpD和△kdpE的构建

3．1 材料

3．1．1 菌株、质粒和引物

3．1．2 试剂及仪器

3．2 方法

3．2．1 敲除突变株△kdpDE、△kdpD和△kdpE的构建

3．3 结果

3．3．1 敲除突变株△kdpD的构建

3．3．2 敲除突变株△kdpE和△kdpDE的构建

3．4 讨论

4 生物学表型特征研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 实验仪器

4．1．3 主要试剂

4．2 方法

4．2．1 突变株的遗传稳定性检测

4．2．2 细菌的生长速率比较

4．2．3 胞外蛋白酶活性检测

4．2．4 细菌泳动实验

4．2．5 生物被膜形成能力检测

4．2．6 半数致死率(LD50)检测

4．2．7 统计学处理

4．3 结果

4．3．1 突变株的遗传稳定性

4．3．2 细菌的生长速率比较

4．3．3 泳动性实验

4．3．4 生物被膜形成能力检测

4．3．5 半数致死量测定LD50

4．4 讨论

5 突变株在水体和鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果分析

5．1 实验材料

5．1．1 菌株、质粒和实验鱼

5．1．2 实验仪器与试剂

5．2 方法

5．2．1 突变株在水体中的存活能力检测

5．2．2 突变株在鱼体内的存活能力检测

5．2．3 菌液的制备与接种

5．2．4 免疫保护率的测定

5．2．5 统计学处理

5．3 结果

5．3．1 突变株在水体中的存活能力检测

5．3．2 突变株在鱼体内的存活能力检测

5．3．3 免疫保护率

5．4 讨论

6 结论

6．1 溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE基因的克隆和生物信息学分析

6．2 无标记基因框内敲除突变株的构建

6．3 突变株△kdpDE、△kdpD和△kdpE的生物学表型特征研究

6．4 突变株在水体和鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果分析

参考文献

致谢

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