发酵梅香鱼微生物种群结构分析及发酵菌株筛选研究

摘要

传统发酵梅香鱼是依靠自然富集的微生物参与的发酵过程，由于受多种因素的影响，参与发酵的微生物不稳定，导致产品质量极不稳定。为了有效控制产品的质量与品质，本课题利用非可培养水平与可培养水平技术对广东特色发酵梅香鱼进行微生物多样性分析，获得种群结构，以此分离出参与自然发酵的优势菌株，并制备出不同发酵制剂，并人工模拟自然发酵工艺制备发酵鱼，并对其进行品质质量鉴定。研究结果如下:
　　(1)未可培养水平下梅香鱼微生物种群结构分析:本研究直接从梅香鱼中提取细菌的总DNA，对其进行琼脂糖凝胶电泳检测，再利用细菌16S rDNA V4区的引物对符合要求的总DNA进行V4区的PCR扩增，继而对PCR产物进行Illumina测序。通过对样品16S rDNA V4可变区的PCR产物的测序结果进行分析，得到样品在0.03距离下的OTU丰度，并绘制稀释曲线图，可以看出参与其发酵的微生物组成非常丰富，其中共有8个门被检测到，分别是酸杆菌门(0.93％)、放线菌门(3.35％)、脱铁杆菌门(1.31％)、厚壁菌门(74.92％)、浮霉菌门(0.16％)、变形菌门(18.11％)、柔膜菌门(0.04％)及疣微菌门(0.09％)，其中优势菌门是厚壁菌门。在厚壁菌门中，丰度最高的菌属分别是乳杆菌属(25.36％)、葡萄球菌属(19.27％)和四联球菌属(14.62％)，可被认为是参与发酵过程的优势菌属。
　　(2)梅香鱼发酵菌株的筛选:本实验利用MRS(de Man, Rogosa and Sharp)、GAM（Gifu anaerobic medium）和TSA(Trypticase Soy Agar)平板对梅香鱼中微生物进行分离、纯化，通过革兰氏染色共筛选得到95株G+菌株，根据发酵菌株的要求，即过氧化氢酶阳性、发酵葡萄糖产酸不产气、可耐受20％ NaCl、不产生组胺，且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用，筛选到3株适合发酵的菌株。利用细菌通用引物1492 R和27 F作正反向引物进行16S rDNA扩增与测序，经Blast在线比对与系统发育树分析，确定3株菌分别为Tetragenococcus halophilus、Staphylococcusxylosus和 Staphylococcus saprophyticus。
　　(3)不同发酵剂对发酵鱼品质的影响:通过绘制3株菌在10、20、30℃下的生长曲线，根据生长曲线选出最适发酵时间和温度，分别为44 h和20℃。在该温度下，设计Box-Behnken试验，选取3株菌不同接种比例，即嗜盐四联球菌接种比例(0、1、2)、木糖葡萄球菌接种比例(0、1、2)和腐生葡萄球菌接种比例(0、1、2)3个发酵影响显著的因素水平，以感官评分为响应值，设计了三因素三水平共15个试验点的响应面分析。利用Design Expert软件对数据进行二次回归分析，从而确定最佳菌株配比，即嗜盐四联球菌∶木糖葡萄球菌∶腐生葡萄球菌=1∶1∶1。通过测定各个发酵试验组与空白对照组的感官指标、理化指标和微生物指标，得出接种发酵的鱼制品明显优于空白对照组，而混合发酵鱼制品又胜于单菌株发酵，其中以最佳菌株配比发酵的鱼制品最优，其产品香气浓郁，肉质鲜美，弹性足。
　　(4)发酵产品的安全性评价:通过7d灌胃试验，观察6组实验组的小鼠，其形态表现上无明显差异，且与阴性对照组（蒸馏水）小鼠相比也无明显差异。在检测发酵鱼制品对生殖细胞的致突变性时，检测到各个剂量试验组小鼠的精子致畸率与阴性对照组（蒸馏水）相比无显著性差异(p＞0.05)，而阳性对照组（环磷酰胺）与阴性对照组（蒸馏水）及各个剂量试验组相比较差异极显著(p＜0.01)，表明发酵鱼制品对生殖细胞无遗传毒性。通过检测发酵鱼制品对体细胞的致突变性，结果显示各个剂量试验组与阴性对照组（蒸馏水）微核率相比差异不显著(p＞0.05)，阳性对照组（环磷酰胺）微核率与阴性对照组（蒸馏水）及各个剂量组相比均有极显著差异(p＜0.01)，表明发酵鱼制品也对体细胞无遗传毒性。因此可初步判断该鱼制品为安全食品。而用于该制品的微生物发酵剂及发酵过程也被认为是安全的。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 发酵鱼制品的种类及特点

1．1．1 发酵鱼制品的种类

1．1．2 发酵鱼制品的特点

1．1．3 发酵梅香鱼的生产现状与前景

1．2 发酵制品中的微生物

1．2．1 发酵制品中的优势微生物及其作用

1．2．2 乳酸菌

1．2．3 葡萄球菌和微球菌

1．2．4 酵母菌和霉菌

1．3 微生物发酵剂的筛选

1．3．1 发酵菌株的筛选来源

1．3．2 发酵菌株的筛选依据

1．3．3 混合菌株发酵剂

1．4 微生物的种群结构分析

1．4．1 可培养水平下的微生物培养法

1．4．2 未可培养水平下的分子生物技术

1．5 本课题研究目的及意义

1．6 本课题研究内容

2 未可培养水平下梅香鱼微生物种群结构分析

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 主要分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 梅香鱼总DNA的提取

2．2．2 总DNA的浓度与OD值260／280的检测

2．2．3 梅香鱼中细菌16S rDNA V4区的PCR扩增

2．2．4 Illumina测序

2．2．5 生物信息分析

2．3 实验结果与分析

2．3．1 梅香鱼16S rDNA总DNA提取结果

2．3．2 细菌16S rDNA V4区PCR扩增

2．3．3 测序及序列拼接

2．3．4 OTU(Operation Taxonomic Unit)分析

2．3．5 Alpha多样性分析

2．3．6 细菌种群结构分析

2．4 小结与讨论

3 梅香鱼发酵菌株的筛选

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器

3．1．4 实验培养基

3．1．5 主要分析软件

3．2 实验方法

3．2．1 菌种的分离

3．2．2 发酵菌种的筛选

3．2．3 发酵菌株的保藏

3．2．4 发酵菌株的鉴定

3．3 实验结果与分析

3．3．1 菌株的分离

3．3．2 三株发酵菌株的16S rDNA测序

3．3．3 三株发酵菌株的鉴定

3．4 小结与讨论

4 不同发酵剂对发酵鱼品质的影响

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验仪器

4．1．4 实验培养基

4．2 实验方法

4．2．1 发酵时间和温度的确定

4．2．2 三株菌之间拮抗作用测试

4．2．3 不同发酵剂的设计

4．2．4 发酵鱼感官评定

4．2．5 理化指标测定

4．2．6 质构测定

4．2．7 挥发性成分的测定

4．2．8 大肠杆菌及致病菌的检测

4．3 实验结果与分析

4．3．1 不同发酵温度的生长规律

4．3．2 三株菌的拮抗性选择

4．3．3 发酵菌株配比优化试验

4．3．4 感官特性评价

4．3．5 理化特性评价

4．3．6 质构结构分析

4．3．7 发酵组样品与空白对照组样品的挥发性成分分析结果

4．3．8 大肠菌群及致病菌

4．4 小结与讨论

5 发酵产品的安全性评价

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验仪器及工具

5．1．4 主要分析软件

5．2 实验方法

5．2．1 样品预处理

5．2．2 试验分组

5．2．3 小鼠形态观察

5．2．4 雄性小鼠精子畸形试验

5．2．5 小鼠骨髓细胞微核试验

5．3 实验结果与分析

5．3．1 灌胃后小鼠形态观察

5．3．2 小鼠精子畸形试验分析

5．3．3 小鼠骨髓细胞微核试验分析

5．4 小结与讨论

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

致谢

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