慢性髓系白血病STI571耐药中PTP活性检测和Bcr-Abl基因ATP结合区的测序分析

摘要

研究背景和目的：慢性髓系白血病(CML)是一种累及造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病。Ph染色体是其肿瘤恶性克隆标志，所形成的BCR-ABL融合基因编码的p210BCR/AB，具有异常增高的蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性，是导致慢性髓系白血病发生的根本原因。细胞内蛋白质磷酸化的平衡状态有赖于蛋白激酶和蛋白磷酸酶的协同作用，酪氨酸残基(Tyr)的磷酸化是一个可逆的动态过程，主要受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP)两大酶家族控制，他们相互拮抗与协调，在机体内构建了一个Tyr磷酸化状态的调节网络。 通过抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶活性，进而抑制CML细胞增殖并诱导CML细胞凋亡是治疗CML新的策略。STI571又名甲磺酸伊马替尼(Imatinibmesylate)、格列卫(Gleevec)，是第一个被批准上市的酪氨酸激酶抑制剂，作用靶点为bcr/abl蛋白酪氨酸激酶，它能竞争性抑制ATP或底物与酪氨酸激酶催化中心结合，阻滞酪氨酸激酶活化作用，阻断其下游信号转导，直接靶向费城染色体(Philadelphiachromosome，Ph)阳性细胞，从而阻止细胞的增殖和肿瘤的形成。本课题组前期研究结果：STI571处理K562细胞后，PTP家族的部分成员表达上调，提示有相关PTP参与了STI571诱导K562细胞凋亡的过程。随着临床应用病例数的增加，STI571的耐药问题引起了人们的关注。尤其是该药对CML急变期的病人治疗效果不理想，耐药问题已成为是抗肿瘤治疗失败的主要原因。 目前的研究表明，STI571的耐药机制有多种，包括非特异的多药耐药基因表达Bcr-Abl基因本身的遗传变异和其它蛋白激酶的活化等等。原发耐药绝大多数与Bcr-Abl融合基因无关，获得疗效后再次复发者，大多数与Bcr-Abl酪氨酸激酶的再活化相关，目前认为主要原因之一是Bcr/Abl融合基因ATP结合区的点突变。 本实验拟通过耐药细胞系K562/G01的基因表达谱芯片检测、胞浆蛋白PTP活性分析，初步确立了参与STI571的耐药过程的部分PTP成员；同时，对临床应用STI571治疗的CML病人进行PTP活性检测和Abl基因ATP结合区序列分析，以确立二者在STI571耐药诊断中的临床意义。 研究方法：1.K562/G01细胞系在本实验室条件下的耐药特性的鉴定：用MTT法检测STI71对细胞的细胞毒作用、Hoechst33342荧光染色检测调亡情况。 2.利用cDNA表达谱芯片技术初步筛选耐药细胞K562/G01与K562/W差异表达基因，应用半定量RT-PCR技术验证芯片结果；进一步检测耐药细胞K562/G01、对STI571耐药的CML病人单个核细胞胞浆蛋白PTP活性，了解PTP与耐药的相关性。 3.将CML病人分为对STl571耐药和非耐药两组，进行骨髓单个核细胞Abl基因ATP结合区序列分析，了解Abl酪氨酸激酶ATP结合区点突变情况。PCR产物的序列长度为344bp，其中的180bp(98bp～277bp)为Abl激酶的第906bp～1085bpDNA序列片段，涵盖了Abl激酶的ATP结合区序列。 研究结果：1.MTT法检测细胞STI571耐药性：K562-W和K562/G01的IC50(半数抑制浓度)分别为(0.48±2.04)uM和(5.67±1.52)uM，K562/G01的耐药倍数为(11.8+1.35)倍。Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡百分率：STI571浓度4.0uM培养24h后活细胞百分数仍达98.5％，说明K562/G01对抗STI571的调亡作用明显增强。。 2.耐药细胞K562/G01基因表达谱芯片分析发现：总共有566个基因出现差异表达，297个基因表达下调，269个基因表达上调，其中1个PTP成员出现表达下调[PTPRF(PPFIA4)基因，Ratio0.413，GenbankID：NM_015053]，1个PTK成员表达升高(PTK9基因Ratio=2.004，GenebankID：NM198974)。半定量RT-PCR验证符合芯片结果。 3.胞浆蛋白PTP活性检测：K562/G01细胞胞浆蛋白PTP活性(126.45pmol/min/ug)较K562/W活性(137.32pmol/min/ug)降低；耐药组病人骨髓单个核细胞胞浆蛋白PTP活性(均数为124.83±12.14pmol/min/ug)较非耐药组病人(均数138.75±13.29pmol/min/ug)也降低，P=0.04。 4.K562/G01耐药细胞Abl激酶ATP结合区DNA测序：碱基序列与K562/W相同，与Abl激酶原序列相比，有两个同义点突变，第1062碱基A被G替换，第1085碱基A被G替换；均位于密码子第3个碱基，为同义密码子，未导致氨基酸的改变。 CML病人骨髓细胞Abl激酶ATP结合区测序结果发现：在8例耐药急变的病人中2例病人第944位核苷酸C→T单个碱基出现点突变，使苏氨酸(Thr)突变为异亮氨酸(Ile)。1例CML-CP的病人第1070碱基A→G替换，导致357位赖氨酸(Lys)→精氨酸(Arg)。 主要结论：1.K562/G01耐药细胞cDNA表达谱芯片分析发现PTP家族有1个成员PTPRF(PPFIA4)表达下调，耐药细胞和临床耐药组病人胞浆蛋白PTP活性均降低。说明PTP家族部分成员可能参与了STI571的耐药机制，PTP活性降低可以提示病人临床出现STI571耐药倾向。 2.在8例STI571耐药急变的CML患者中，2例检测出Bcr-Abl激酶ATP结合区第944位核苷酸点突变(C→T)，导致氨基酸Thr→Ile的改变，证实该类型点突变是导致CML患者对STI571产生耐药性的原因之一，对指导临床用药具有重要价值。

目录

文摘

英文文摘

前言

第1章慢性髓系白血病STI571耐药中PTP活性检测

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

附图

第2章 CML中Ab1基因点突变的研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

附图

全文小结

参考文献

英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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