壳聚糖-siRNA分子纳米载体的制备、鉴定和基因沉默效应

摘要

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物体内的一种自然现象：导入生物体内的或内源性转录生成的一种双链RNA分子，与同源的mRNA结合并使其降解，可介导对应基因转录后的沉默。一方面，干扰RNA技术可作为研究和鉴别基因表型及功能的强有力工具，为疾病发生机理、疾病基因治疗靶点的鉴别以及新药研发如小分子化合物和抗体类药物的发现提供理论依据；另一方面，在前面研究的基础上，干扰RNA技术可用于人体疾病的治疗。小分子干扰RNA(small intefering RNA，siRNA)是RNAi基因抑制功能的效应分子，具有核酸和小分子化合物的双重特性，易被核酸酶降解，具有稳定性差、半衰期短、细胞内转染效率低和靶向性差等缺点，因此，应用siRNA分子的关键是如何有效地使其穿过细胞膜，进入细胞质中的RNAi通路。阳离子脂质体、病毒载体、一些物理技术如基因枪和电转染等均可介导其转染进入细胞内。但是，将siRNA分子导入生物体内治疗疾病要复杂得多。病毒载体基因转染率高，但具有潜在的致癌性和免疫原性；阳离子脂质体具有较大的细胞毒性和不稳定性。近年来，有文献报道使用阳离子聚合物壳聚糖作为核酸类分子的载体，在体外细胞实验和生物体内应用都取得了较好的效果。 壳聚糖(chitosan，α(1-4)2-amino-2-deoxy-β-D-glucan)是一种极具潜力的天然阳离子多聚糖，提取自海洋甲壳类生物，是甲壳素脱乙酰化的产物。壳聚糖来源广泛，具有较好的生物相容性和生物可降解性，低毒，低免疫原性。因此，壳聚糖被广泛地应用于药剂学研究、制药工业以及生物材料工程(如人工皮肤)等方面。近年来，有人尝试将壳聚糖作为基因药物的生物体外及生物体内给药系统，取得了很好的效果。壳聚糖是唯一一个具有弱碱性的多糖，在酸性溶液中，壳聚糖分子中的氨基基团解离，使多糖带上高密度的正电荷，因而能与带负电荷的核酸通过静电作用结合，自聚集形成纳米粒或微粒，对核酸分子具有一定程度的保护作用，使其免受核酸酶的降解。壳聚糖与核酸聚集形成的微粒易被网状内皮系统摄取，经细胞内吞进入胞内，在溶酶体中壳聚糖被降解，释放出核酸分子。壳聚糖还具有黏膜黏着剂的性质，与核酸聚集形成的微粒容易被粘膜上皮细胞摄取，并能将核酸分子带过粘膜细胞，增强核酸分子的转染能力。因此，壳聚糖聚合物能有效地解决基因转染过程中的一些关键问题，如细胞吸收、胞内的释放和核定位等，作为基因递送载体的应用前景看好。siRNA分子同为核酸类分子，为了探索壳聚糖作为siRNA载体的可行性，本研究中以壳聚糖为载体材料，采用复凝聚法制备了载质粒DNA的壳聚糖纳米粒，对其结构特征(structural feature)进行了鉴定、对细胞的基因转染效率进行了测定；并制备了载siRNA分子的壳聚糖纳米粒，研究了其在体外细胞水平对目的基因FHL2的RNAi效应，为进一步的体内应用研究奠定了基础。 目的： 1．探讨聚阳离子壳聚糖纳米粒作为siRNA分子给药系统的可行性。 2．制备载报告基因pGFP的壳聚糖纳米粒，研究纳米粒的结构特征以及对体外细胞的基因转染效率，证明壳聚糖能作为DNA类核酸类分子的载体。 3．制备载siRNA分子的壳聚糖纳米粒，研究纳米粒能否将siRNA分子递送到体外培养的细胞中，证明壳聚糖能作为sirNA分子的给药载体。 4．研究所制备的壳聚糖纳米粒能否介导siFHL2分子有效转染细胞，并沉默靶基因：FHL2的表达。 方法： 1．用表达绿色荧光蛋白的质粒(plasmid)pGFP作报告基因，采用复凝聚法制备壳聚糖-pGFP纳米粒。1.0％琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖和pDNA的结合能力，通过比色法检测其包封率，用原子力显微镜、扫描电子显微镜和激光纳米粒度仪对纳米粒的形态和粒径分布进行考察。 2．壳聚糖-pGFP纳米粒转染体外培养的人结肠腺癌细胞系LoVo，通过荧光显微镜观察LoVo细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，用脂质体(Iffpofectamine2000)转染pGFP作为阳性对照，考察壳聚糖纳米粒介导pGFP对LoVo细胞的转染效率。 3．用FAM标记对照sirNA分子，复凝聚法制备壳聚糖．对照siRNA纳米粒，体外转染LoVo细胞，用激光扫描共聚焦显微镜(confocal microscopy)观察LoVo细胞中的绿色荧光(代表转染进入细胞的siRNA分子)，考察壳聚糖纳米粒介导siRNA对LoVo细胞的转染效应及其在细胞中的分布。 4．合成能特异性沉默靶基因FHL2的siRNA分子(siFHL2)，复凝聚法制备壳聚糖-siFHL2纳米粒，体外转染LoVo细胞，脂质体转染siFHL2作为阳性对照，同时转染壳聚糖一对照siRNA纳米粒作为对照。采用半定量RT-PCR方法(semi-quantitative RT-PCR)检测LoVo细胞中FHL2 mRNA的表达水平，考察壳聚糖纳米粒介导siFHL2分子转染LoVo细胞后对FHL2基因的RNAi效应。siFHL2分子的序列为： 正义链：5’-CGAAUCUCUCUUUGGCAAGdTdT-3’； 反义链：5’-dTdTGCUUAGAGAGAAACCGUUC-3’。 GAPDH的PCR引物序列为： 正义链(GF)：5’-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3’； 反义链(GR)：5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’。 FHL2的PCR引物序列为： 正义链(FF)：5’-ATGACTGAGCGCTTTGACTG-3’； 反义链(FR)：5’-AGTTCAGGCAGTAGGCAAAGTC-3’。 结果： 1．制备得到壳聚糖-pGFP纳米粒。经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，大部分pGFP均滞留在加样孔中，说明pDNA与壳聚糖之间通过静电作用而几乎完全结合；比色法测得壳聚糖对质粒的囊化率大于90％。原子力显微镜下见壳聚糖-pGFP纳米粒为结构紧密的不规则球形，粒径略小于200 nm，激光纳米粒度仪测得平均粒径为209nm，多分散指数为0.15。扫描电镜下观察到纳米粒冻干粉(lyophillization)形状不规则，呈膨松的片层状或树枝状，乙醇分散后呈梭形颗粒，大小不均。 2．将壳聚糖-pGFP纳米粒体外转染LoVo细胞后，荧光显微镜下观察到细胞中有绿色荧光表达，说明壳聚糖能介导pGFP转染LoVo细胞并在细胞中表达GFP蛋白。壳聚糖纳米粒转染组表达绿色荧光蛋白细胞比脂质体转染组少，说明壳聚糖纳米粒的转染效率比脂质体低。 3．制备得到壳聚糖．对照siRNA纳米粒。将纳米粒体外转染LoVo细胞后，用激光扫描共聚焦显微镜观察，大部分细胞中均有绿色的荧光点，即为转染进入细胞的siRNA分子。这些绿色荧光点主要分布于胞浆中，沿胞膜内侧和核膜(nuclear membrane)胞浆侧也有分布，与脂质体-siRNA复合物转染组一致，而阴性对照组细胞中则无绿色荧光点。说明脂质体复合物和壳聚糖纳米粒均将对照siRNA分子递送入了LoVo细胞中。 4．制备得到壳聚糖-siFHL2纳米粒，体外转染LoVo细胞后，提取各组LoVo细胞总RNA，分别用RT-PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。灰度扫描目的条带后对各组间FHL2 mRNA的相对表达量行单向方差分析(one-wayANOVA)，结果具有显著性差异(F=1138.441，P<0.001)。再对各组间。FHL2mRNA的相对表达量行多重比较(LSD检验)，统计结果表明，壳聚糖纳米粒能介导siRNA分子特异性沉默靶基因FHL2的表达，与对照组相比均有显著性差异(P<0.001)，与脂质体复合物转染组相比无显著性差异(P=0.219)；而对照siRNA分子即使进入细胞也不能对靶基因产生RNAi效应，与正常细胞对照组比较无显著性差异(P=0.298)。 结论： 1．壳聚糖可以有效凝聚pDNA，采用复凝聚法可制得粒径在100～500 nm范围带正电荷的纳米粒，有较高的包封率。纳米粒冷冻干燥过程中聚集，导致形态和粒径均产生较大的变化。 2．壳聚糖纳米粒在体外能将质粒DNA递送到细胞内，且报告基因能在细胞内表达。 3．壳聚糖纳米粒可以将siRNA分子递送进入体外培养的细胞中，并对靶基因产生特异性的RNAi效应。因此壳聚糖作为非病毒基因载体具有介导核酸类生物分子的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分载报告基因pGFP的壳聚糖纳米粒的制备和鉴定

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

第二部分壳聚糖-siRNA纳米粒的制备及对LoVo细胞中FHL2基因的RNAi效应

1.引言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果

附录

致谢