神经母细胞瘤B104细胞株条件培养基促进少突胶质前体细胞增殖的机制研究

摘要

目的：鉴定介导神经母细胞瘤 B104细胞株条件培养液(B104 neuroblatoma cells conditioned medium, B104CM)中诱导少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)增殖的关键因子，并探讨B104CM诱导OPCs增殖的信号转导机制。
　　方法：（1）培养B104神经母细胞瘤细胞株，离心过滤收集条件培养液。（2）手术分离取出 E16天 SD大鼠胎鼠的脊髓，消化分离细胞，以免疫粘附法得到纯化的OPCs，进行原代培养。（3）用免疫荧光染色法标记OPCs特异性标志物鉴定OPCs。（4）将不同浓度的B104CM(0，10％，30%，50%，100%)加入到无生长因子的少突胶质前体细胞培养物中，以BrdU掺入染色法结合A2B5染色鉴定OPCs的增殖。（5）以逆转录RT-PCR检测PDGF-AA、bFGF和IGF-1 mRNA在B104细胞的表达，以酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测B104CM中 PDGF-AA、bFGF和 IGF-1的蛋白含量，通过免疫荧光染色来验证 PDGFR、FGFR2和IGFR在OPCs上的表达，筛选出可能促进OPCs增殖的候选生长因子。（6）应用生长因子受体的特异性抑制剂观察B104CM中候选生长因子对OPCs增殖的影响，最终鉴定出B104CM中影响OPCs增殖的关键因子。（7）蛋白质印迹法(Western Blot)检测Erk1/2、PI3K、p38和JNK在B104CM诱导OPCs增殖中的活化（磷酸化）。（8）RT-PCR和Real-time-PCR法检测B104CM诱导OPCs增殖过程中可能涉及的立早基因和细胞周期蛋白的表达变化。
　　结果：（1）成功分离、培养出OPCs，其纯度高达95%以上。（2）BrdU掺入法结合A2B5染色证实B104CM可诱导OPCs的增殖。（3）RT-PCR结果证明B104细胞表达PDGF-AA、bFGF和IGF-1 mRNA，ELISA检测到PDGF-AA、bFGF和IGF-1三种生长因子在无浓缩的B104CM中的浓度分别达到23.42±4.28、12.94±3.05和7.21±2.12 ng/ml；免疫荧光染色发现 OPCs表达 PDGFR、FGFR和 IGFR。（4） PDGFR、FGFR信号的抑制剂AG1295和PD173074显著降低B104CM诱导的OPCs增殖，但IGFR的抑制剂无明显影响。（5）Western Blot结果证明，B104CM诱导OPCs内Erk1/2和JNK的活化（磷酸化）；Erk1/2的抑制剂U0126和JNK的抑制剂 SP600125均可显著降低 B104CM诱导 OPCs增殖。（6）RT-PCR结果证明， B104CM可刺激立早基因c-fos、c-jun、Id-2和细胞周期蛋白cyclin D1、D2、E表达的增加，且Erk抑制剂可抑制其表达。（7）B104CM刺激立早基因c-jun，c-fos， c-myc表达的增加，但降低SMAD4和ATF-2的表达，且JNK抑制剂可分别抑制和恢复其表达。
　　结论：1. PDGF-AA和bFGF是介导B104CM诱导OPCs增殖的关键因子。2. Erk1/2信号通路的激活是B104CM诱导OPCs增殖的关键分子事件，B104CM激活Erk1/2信号通路，并启动下游立早基因c-jun，c-fos，Id-2和细胞周期蛋白cyclin D1，cyclin D2和cyclin E等转录因子的表达，启动OPCs的增殖。3. JNK信号通路的激活也是B104CM诱导OPCs增殖所必需的，B104CM活化JNK信号通路，并上调下游立早基因c-jun，c-fos，c-myc的表达和下调SMAD4和ATF-2的表达，参与B104CM诱的OPCs增殖过程。

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前言

材料与仪器

1 材料

方法

1 OPCs培养和鉴定

2 B104CM的制备

3 BrdU掺入法

4 逆转录PCR （RT-PCR）

5 酶联免疫吸附测定ELISA

6 蛋白免疫印迹Western Blot

7 Real-time RT-PCR

8 统计学分析

结果

1 OPCs的培养与鉴定

2 B104CM诱导OPCs增殖

3 Erk1/2信号途径在B104CM诱导OPCs增殖中的作用

4 JNK信号途径在B104CM诱导OPCs增殖中的作用

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A 主要英文缩略词

附录B 个人简历和发表论文

附录C 综述:少突胶质细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展