欧文氏杆菌CXJZ11-01基因组文库构建及木聚糖酶基因克隆

摘要

木聚糖酶在饲料、制浆造纸、食品、医药、能源工业领域具有广阔的应用前景。随着分子生物学、结构生物学及蛋白质工程的发展，木聚糖酶结构和功能的研究不断取得新的突破；有关木聚糖酶基因的研究也取得了很大进展，不仅克隆出了许多不同来源的木聚糖酶基因，而且初步明确了木聚糖酶基因在同源和异源宿主中的表达和分泌机制。 中国农业科学院麻类研究所刘正初研究员等在国内外率先采用基因工程手段，将编号为ly菌株的质粒转化到西Erwiniacarotovora中，获得一系列欧文氏杆菌变异菌株。本研究在前期工作基础上，筛选到了高产木聚糖酶的菌株欧文氏杆菌CXJZ11-01，构建了其功能基因组文库，从中克隆出木聚糖酶基因，明确了该基因的分子结构，为构建木聚糖酶基因高效表达体系和获得草本纤维精制高效工程菌株等深入研究奠定了基础： 1、采用产木聚糖酶菌株选择培养基及DNS检测方法，从300多个欧文氏杆菌变异菌株中筛选出木聚糖酶高产菌株CXJZ11-01。复筛菌株在筛选平板上的透明圈大小和测定其发酵液木聚糖酶活性的结果一致表明，CXJZ11-01的木聚糖酶活性>>CXJZ11-03>CXJZ11-02>T85-1。 2、通过提取CXJZ11-01菌株的DNA和优化酶切、连接、转化技术体系，构建了草本纤维提取高效菌种CXJZ11-01的木聚糖酶功能基因组文库。直接回收大小在1-5kb之间的酶切DNA片段进行转化，采用透明圈法筛选获得了2个木聚糖酶基因阳性克隆。 3、从阳性克隆中提取质粒，采用酶切和PCR方法对酶切片段进行鉴定、序列测定，获得了木聚糖酶基因克隆，该基因已经登陆GenBank，登陆号为EU233656。对该木聚糖酶基因进行生物信息学分析与表达研究结果证明，该基因片断长度为708bp，包括一个长度为642bp的完整开放阅读框，编码213个氨基酸，分子量为23.36KDa。该基因翻译的213个氨基酸可能有29个氨基酸的信号肽序列，编码的蛋白为胞外蛋白，属于糖苷水解酶第11类。

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文摘

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论文说明:英文缩略表

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第一章 绪论

1.1木聚糖

1.2木聚糖酶

1.2.1木聚糖酶定义

1.2.2木聚糖酶的来源

1.2.3木聚糖酶的性质

1.2.4木聚糖酶的分子生物学

1.2.5木聚糖酶的基因克隆

1.2.6木聚糖酶的应用前景

1.3本研究的目的与意义

1.4研究内容及技术路线

第二章 木聚糖酶高产菌株的筛选*

2.1实验材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2实验结果

2.2.1菌种筛选

2.3.2木聚糖酶活性测定

2.3结论与讨论

第三章 欧文氏杆菌CXJZ11-01基因组文库的构建

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2实验结果

3.2.1基因组DNA提取

3.2.2基因组DNA的酶切

3.2.3基因组DNA的连接转化

3.2.4基因组文库构建

3.3结论与讨论

第四章 木聚糖酶基因克隆与鉴定

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2实验结果

4.2.1阳性克隆筛选

4.2.2阳性克隆鉴定

4.2.3 DNA序列测定

4.2.4生物信息学研究

4.3 讨论与结论

第五章 全文结论

参考文献

致 谢

作者简历