口蹄疫病毒Asia1/1/YZ/CHA/06的全基因组序列分析

摘要

口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其病原口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8.5kb，可直接作为mRNA，编码并翻译出一个多聚蛋白，然后经过一系列裂解，产生4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和10种非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B1、3B2、3B3、3C和3D)。根据动物交叉保护和血清学试验，FMDV可分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial型共7种血清型，不同血清型间不能交叉免疫保护，给口蹄疫的控制和消灭造成了极大的困难。目前FMD呈世界范围的流行趋势，但其血清型的分布具有一定的地理区域性。我国于1958年在云南保山县首先发现Asial型FMD，且在之后30多年里该型FMDV的流行仅局限于Asial/YNBS/58谱系，但2005年以来我国在江苏、甘肃、北京、河南等地爆发了江苏谱系Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05)，该谱系毒株与Asial/YNBS/58株相比有较大的遗传偏离，来源于印度1980年流行毒株(Asial/IND/1980)。该谱系毒株在我国牛群中一经流行，趋势迅猛，造成的损失极为严重，因此积极开展Asial型FMD江苏谱系毒株的研究，对我国FMD的防控具有重要的意义。FMDV全基因组的测定和组装，为FMDV致病性的研究、以及新型疫苗和诊断技术的研制奠定了基础。 本研究对分离到的江苏谱系Asial型FMDV猪源毒株Asial/1/YZ/CHA/06进行了测序和全基因组序列分析。同时，根据本实验室已测定的江苏谱系Asial型FMDV牛源毒株Asial/YS/CHA/05全基因组序列的基础，利用5’RACE方法从Asial/YS/CHA/05株细胞传代毒中扩增得到5’末端的真实序列，采用常规RT-PCR技术扩增得到六段相互重叠基因组片段，分别克隆至pOK12低拷贝载体中进行序列测定和克隆拼接，构建了Asial/YS/CHA/05株全长cDNA。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略表

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第一章绪论

1.1口蹄疫简介

1.2口蹄疫病毒的形态结构和理化特性

1.3口蹄疫病毒分子生物学特性

1.3.1基因组的结构与功能

1.3.2病毒结构蛋白及其功能

1.3.3病毒非结构蛋白及其功能

1.3.4口蹄疫病毒的复制过程

1.4病毒的遗传变异

1.5口蹄疫的防控措施及难点

1.6本研究的目的和意义

第二章猪源Asial型口蹄疫病毒全基因组序列的测定与分析

2.1材料与方法

2.1.1病料、细胞和载体

2.1.2 工具酶与主要试剂

2.1.3仪器设备

2.1.4引物的设计与合成

2.1.5病料的处理及病毒RNA的提取

2.1.6 RT-PCR及分子克隆

2.1.7全基因组的扩增

2.1.8 5'RACE方法扩增并克隆基因组最末端

2.1.9序列测定和分析

2.2结果

2.2.1 PCR检测为Asial型口蹄疫病毒

2.2.2基因组各片段的PCR扩增、克隆与序列测定

2.2.3基因组5'末端真实序列的克隆与测定

2.2.4 5'UTR和3'UTR二级结构分析

2.2.5猪源病毒与参考毒株的序列同源性及遗传演化分析

2.3讨论

2.3.1 FMDV细胞受体结合基序

2.3.2 口蹄疫病毒组织嗜性

2.3.3病毒的抗原性

2.3.4基因组序列测定的准确性

2.4小结

第三章Asial型口蹄疫病毒全基因组序列的组装

3.1材料与方法

3.1.1毒株、菌株、细胞、载体

3.1.2 工具酶与主要试剂

3.1.3仪器设备

3.1.4病毒全基因组拼接策略及组装

3.1.5全基因组组装后测序

3.2结果

3.2.1 FMDV全长cDNA克隆的酶切鉴定

3.2.2 FMDV基因组全长cDNA的修正

3.3讨论

3.3.1 poly(C)序列

3.3.2 非病毒碱基的引入

3.3.3质粒的不稳定性

3.4小结

第四章全文结论

参考文献

致谢

作者简历