CRISPR/Cas9介导的大豆基因组定点编辑研究

摘要

大豆（Glycine max(L.) Merr.）是一种具有极大经济价值的豆科作物，也是人类食物中植物蛋白质的主要来源。随着全世界人口的持续增长，大豆的需求量也日益增加，开发用于大豆遗传改良的新技术对于研究大豆基因功能、培育新品种等具有重要意义。近年来，CRISPR/Cas9系统已经成功在多种重要作物中实现了基因编辑，但是在大豆中的应用并不成熟。本研究中，我们成功构建了大豆的CRISPR/Cas9定点敲除体系并检测了该技术对内源基因及外源导入基因的编辑效率，随后探索了CRISPR/Cas9在大豆中介导基因定点敲入及片段替换的可行性。本研究取得的主要研究结果如下：
　　1、以拟南芥的FEI1、FEI2和SHR基因的蛋白序列为基础序列，在NCBI数据库中与大豆的数据库进行比对，与之同源性最高的基因分别命名为GmFEI1、GmFEI2和GmSHR。本研究中成功克隆到了这三个基因，并用作基因编辑的靶基因。
　　2、本研究中描述了一种在大豆中快速、高特异性的检测CRISPR/Cas9介导的基因组定点敲除效率的方法。为了简化操作和提高转化效率，我们将sgRNA和Cas9的表达盒组装在同一个载体上，Cas9依据双子叶植物密码子偏好做了密码子优化。该CRISPR/Cas9载体构造简单，选中靶基因和相应靶点后，只需要替换sgRNA的序列即可。载体上还带有一个GFP选择标记，可以可视化地快速选择出转化的发状根。
　　3、本研究中，我们设计了一个sgRNA靶向外源导入基因bar和六个sgRNA分别靶向两个大豆内源基因GmFEI2、GmSHR的不同位点，结合大豆发状根转化系统对大豆基因组进行定点编辑，统计每一个靶点的突变效率。检测的170个发状根中有54％在靶点处发生了定点编辑，Indel频率为0.6%~95.0%。其中利用PCR/RE实验检测发现bar-SP1、GmFEI2-SP1、GmFEI2-SP2和GmSHR-SP3靶点的突变率分别为36.7%、60.0%、93.3%和35.7%，Indel频率分别为1.3%~21.0%、0.6%~18.8%、1.0%~95.0%和2.8%~28.7%。利用 T7EI实验检测发现在 GmSHR-SP1和GmSHR-SP2靶点的突变率分别为50.0%和45.4%，Indel频率分别为2.3%~21.3%和8.7%~30.0%。随后测序均发现在靶点处有碱基的插入、缺失及错配突变。结果证明CRISPR/Cas9系统可以在大豆中实现对外源导入基因及内源基因的定点敲除。
　　4、本研究还检测了CRISPR/Cas9系统只使用一个定制的sgRNA同时编辑两个大豆内源基因的潜力。本实验设计的GmFEI2-SP3可以同时靶向GmFEI1和GmFEI2的第三个外显子。利用PCR/RE实验检测发现30个阳性发状根中，有三个在GmFEI1和GmFEI2的靶位点处同时产生了突变，但是Indel的频率并不相同，在GmFEI1靶点的Indel频率分别是32.7%、20.3%和21.6%，而在GmFEI2靶点的Indel频率分别是7.0%、5.4%和27.0%。未切开条带亚克隆测序结果发现GmFEI1和GmFEI2基因的靶点处均出现了碱基的插入和缺失突变，证明了CRISPR/Cas9系统只使用一个定制的sgRNA可实现同时编辑两个大豆内源基因。
　　5大豆发状根转化系统可以实现两个载体的共转化，这为今后研究基因间的相互关系和CRISPR/Cas9的同源重组修复途径提供了更多的理论和技术基础。