TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑及黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析

摘要

本文从以下几个部分展开论述： 一、TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑 大豆[GlycineMax(L.)Merr.]起源于中国，是重要的油料和高蛋白作物，含有多种对人类有益的生理活性物质，如异黄酮等，此外大豆也是农业生产体系中重要的养地作物（能固氮，对化肥需求较少）。基因组定点编辑技术（或称基因打靶技术）是对基因组特定位点进行操作，诱发该位点DNA序列的改变，如碱基的插入缺失、基因的插入或替换以及大片段DNA的缺失等。目前应用比较广泛的是转录激活样效应因子核酸酶(Transcription Activator-like Effectors Nucleases，TALENs)和Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9技术。基因组定点编辑技术依赖于转基因技术，但基因编辑后的生物可以不含任何新引入的遗传物质或外源DNA，是一种“非转基因的遗传修饰”。相比于传统育种技术的周期长、效率低的缺点，以及转基因育种技术中引入外源DNA的生物安全问题，基因组定点编辑技术在育种的效率和可控制性等方面明显优于前者。本研究探索了TALENs和CRISPR/Cas9技术在大豆基因组定点编辑中的应用，比较两种技术的打靶效率及特点，构建了大豆基因组高效定点突变的技术平台。主要研究结果如下: 1、TALENs技术在大豆基因组定点编辑中的应用。选择编码八氢番茄红素脱氢酶的GmPDS11(Glyma.11G253000)和GmPDS18(Glyma.18G003900)为打靶基因，并设计了2种类型的基因打靶:D1同时靶向2个基因;S1和S2特异靶向GmPDS11。通过大豆毛状根转化并对毛状根进行DNA提取与突变位点的检测，发现单个位点发生突变的效率在17.5-21.1％之间，D1同时打靶2个位点的效率是6.25％。突变类型主要是碱基(1～30bp)的缺失，较少发生碱基的插入。TALENs优先结合第“0”号位置为T碱基的靶位点（天然存在的TALE靶位点第“0”号位几乎都为T），但是这种偏好性不是严格的，也可以结合第“0”号位置为C碱基的靶位点。 2、CRISPR/Cas9技术在大豆基因组定点编辑中的应用。选择GmPDS11和GmPDS18为打靶基因，并设计了2种类型的基因打靶:D7同时靶向2个基因;S11和S12特异靶向GmPDS11，S13特异靶向GmPDS18。打靶效率的评价采用同TALENs技术一样的方法。当使用拟南芥U6-26启动子的Cas9载体pSC-AtU6时，单个位点发生突变的效率在11.7-18.1％之间，D7同时打靶2个位点的效率是12.5％。突变类型主要是碱基(1～38bp)的缺失或插入。在大豆全基因组水平上鉴定了8个U3和11个U6基因，并用GmU6-16g-1启动子替换pSC-AtU6载体中的拟南芥U6-26启动子得到pSC-GmU6载体。当使用pSC-GmU6载体时，D7的打靶效率是43.4％(GmU6-16g-1启动子长度616bp)和48.1％(GmU6-16g-1启动子长度350bp)，并且均是同时打靶2个基因。此外将D7-pSC-AtU6载体通过子叶节稳定遗传转化技术转化大豆，在继代培养阶段观察到白化的不定茅(pds突变表型)。 3、TALENs和CRISPR/Cas9技术在大豆基因组定点编辑中应用的比较。首先在载体构建方面，TALENs的组装虽有试剂盒，但组装的过程也比较费时费力，需要依赖大量的工作，Cas9载体构建较为简便，只需要简单的酶切连接。其次在打靶效率方面，靶向一个位点时，TALENs技术的打靶效率要高于使用AtU6-26启动子的CRISPR/Cas9技术，但低于使用GmU6-16g-1启动子的CRISPR/Cas9技术;靶向2个位点时，不论使用AtU6-26还是GmU6-16g-1启动子的CRISPR/Cas9技术都要优于TALENs技术。使用GmU6-16g-1启动子的CRISPR/Cas9技术是大豆基因组定点编辑的理想选择。 二、黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析 植物叶色是色素的综合反映，正常情况下叶绿素占主要成分，表现为绿色。叶绿素是光合作用中不可缺少的元件，参与光系统的组装以及光能的吸收转换，它的正常水平的生物合成与降解对于光合微生物和绿色植物至关重要。叶色突变体是研究叶绿素代谢途径、叶绿体发育及其调控、核质信号途径和光合系统等相关基因机理的理想材料。本研究利用EMS诱变处理南农86-4所获得的黄绿叶突变体cd1为材料，通过图位克隆的方法定位cd1基因，并对基因的功能做了进一步的分析。主要研究结果如下: 1、将突变体cd1与Williams82进行杂交构建定位群体，经过BSA混池分析和精细定位发现基因定位于15号染色体M1和150286之间，物理距离为153Kb。在候选区段内有24基因，根据基因的功能注释判断Glyma.15G080200（编码镁离子螯合酶Ⅰ亚基）即为cd1的候选基因。通过设计特异性引物扩增突变体cd1与对照南农86-4的Glyma.15G080200的全长，发现在第三个外显子上有一个点突变G1709A，导致蛋白质第278位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)。通过CRISPR/Cas9技术敲除GmCHLI1b基因，在继代培养阶段观察到黄化的不定芽，提取DNA进行PCR测序检测发现GmCHLI1b基因确实突变了。 2、大豆基因中存在4个GmCHLI拷贝，即GmCHLI1a(Glyma.13G232500)，GmCHLI1b(cd1),GmCHLI2a(Glyma.07G204300),GmCHLI2b(Glyma.13G171800),其中GmCHLI1a/b是镁离子螯合酶Ⅰ亚基的主要形式。与对照GmCHLI1b相比，Gmcd1的ATPase酶活性显著降低。此外酵母双杂交实验也表明突变位点D278N削弱了Gmcd1与其他Ⅰ亚基之间的相互作用，但不影响其与D亚基的互作。 3、利用拂晓、正午、黄昏和子夜四个时间点（V3时期）的转录组数据从整体上分析叶绿素合成途径中相关基因的表达水平，结果显示与对照南农86-4相比，拂晓时突变体cd1中较低的叶绿素含量导致叶绿素合成途径中基因上调表达。随着时间的推移，突变体中镁离子螯合酶的活性不足，阻碍了叶绿素的正常合成途径，反馈调控导致大部分基因的表达呈现下调趋势。此外突变体cd1叶片的SOD、APX和POD的活性都显著增加了，暗示突变体中ROS水平要高于对照，表明叶片的氧化还原平衡被打破。 4、在酵母双杂交(Y2H)系统中，大豆的硫氧还蛋白GmTrxF1/2(Glyma.09G249200/Glyma.18G243200)和硫氧还蛋白还原酶C GmNTRC1/2(Glyma.02G185300/Glyma.10G113100)并不能与GmCHLI1b相互作用。此外双分子荧光互补(BiFC)实验也显示GmTrxF1/2和GmNTRC1/2并不能与GrmCHLI1b相互作用。这些结果暗示着GmTⅨF1/2和GmNTRC1/2可能不直接参与GmCHLI1b的氧化还原调控。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章文献综述

1基因组定点编辑技术的研究进展

1．1归巢核酸内切酶

1．2锌指核酸酶

1．3转录激活样效应因子核酸酶

1．4 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)／CRISPR-associated (Cas) 9技术

2大豆功能基因组学研究进展

2．1正向遗传学——表型到基因

2．2反向遗传学——基因到表型

2．3关联分析与连锁分析在大豆数量性状QTL相关基因挖掘中的作用

3 叶绿素的生物合成、降解代谢及其调控与植物叶色突变的研究进展

3．1叶绿素的生物合成、降解代谢及其调控

3．2植物叶色突变体的研究进展

4本研究目的意义及内容

第二章TALENs与CRISPR／Cas9介导的大豆基因组定点编辑

1材料与方法

1．1植物材料、实验菌株和载体

1．2主要实验试剂及仪器

1．3 RNA的提取及RT-PCR实验

1．4基因打靶位点的设计

1．5大豆U3／U6snRNA的鉴定及序列比对

1．6 TALENs质粒的组装

1．7 CRISPR／Cas9质粒构建

1．8大豆毛状根的诱导

1．9根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化

1．10毛状根DNA的提取与子叶节转化外植体的试纸条检测、DNA提取

1．11打靶位点的突变检测

2结果与分析

2．1打靶基因的选择与打靶位点的设计

2．2大豆基因组U3／U6 snRNA的鉴定与分析

2．3 TALENs质粒的组装与CRISPR／Cas9质粒构建

2．4大豆毛状根的诱导与DNA的提取

2．5大豆毛状根DNA的突变位点检测及打靶效率的评价

2．6 D7载体通过子叶节遗传转化方法转化大豆

3讨论

第三章大豆黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析

1材料与方法

1．1植物材料、实验菌株和载体

1．2主要实验试剂及仪器

1．3定位群体的构建

1．5突变基因cd1的精细定位

1．6多序列的比对和分子进化树的构建

1．7亚细胞定位

1．9 GmCHLI1b基因的敲除

1．10酵母双杂交实验

1．11烟草BiFC

1．12叶绿素生物合成途径的转录组分析

1．13 RNA的提取与RT-PCR

2结果与分析

2．1 cd1基因的精细定位

2．2 GmCHLIs的序列比对与结构分析

2．3 GmCHLIs的亚细胞定位

2．4叶绿素合成途径的转录组分析

2．5突变体叶片中活性氧物质积累情况

2．6 GmCHLI1b基因的敲除研究

2．7 GmCHLI1b与其相关蛋白在酵母双杂交系统中的互作关系

2．8 GmCHLI1b与GmTrxF1／2和GmNTRC1／2在BiFC中的互作关系

2．9突变体cd1中与光合作用相关基因的表达情况

3讨论

全文结论

本研究创新之处

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的论文

致谢