CRISPR/Cas9介导的羊FGF5基因敲除和定点整合MTNR1A基因的方法

摘要

本发明提供一种CRISPR/Cas9介导的羊FGF5基因敲除和定点整合MTNR1A基因的方法。将特异靶向羊FGF5基因第三外显子的CRISPR/Cas9打靶载体和基因同源重组载体共同转入羊胎儿成纤维细胞中，获得羊FGF5基因敲除且定点整合MTNR1A基因的细胞。本发明通过核转的方式将供体载体和打靶载体共转染羊胎儿成纤维细胞，通过Gibson Assembly方法构建的无标记供体载体中CYP17启动子可以使MTNR1A实现在羊卵巢组织中特异性表达。分离鉴定出的阳性单克隆细胞株可作为体细胞核移植的核供体获得克隆胚胎，进而为培育生殖系统局部强化褪黑素信号且多产毛的转基因克隆羊打下坚实基础。