CRISPR/Cas9系统介导羊MSTN基因敲除和定点整合fat-1基因的研究

摘要

提高家畜产肉性能，培育高产优质的肉用家畜新品种是育种工作的目标之一，通过基因编辑技术可以快速改变特定基因组成，获得需要的优良性状。MSTN基因为骨骼肌生长的负调控因子，该基因的突变会导致动物肌肉发达、体重增加;fat-1基因编码ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶，可以将多不饱和脂肪酸从ω-6转化为ω-3形式，fat-1基因的增加有利于提高动物体内ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了敲除山羊MSTN基因的同时在该位点插入fat-1基因的gRNA载体和fat-1基因定点敲入载体，利用电转法将载体转入绒山羊胎儿成纤维细胞中，筛选阳性单克隆细胞，通过体细胞克隆的方法生产转基因绒山羊，期望培育出在提高羊肉产量的同时增加羊肉中ω-3含量的家畜新品种。
　　1、载体的构建
　　本实验成功构建了2对基于MSTN基因一号外显子的gRNA表达载体，通过Survery酶切突变检测gRNA2突变效率高于gRNA1;同时成功构建了含有fat-1外源基因且可以定点整合至宿主基因组MSTN位点的敲入载体5'h-pCAGDNA3-fat-1-3'h。
　　2、转基因单克隆细胞系的筛选
　　本实验使用电转法将线性化的fat-1载体、gRNA2和Cas9载体按比例转入羊胎儿成纤维细胞中，通过流式细胞仪和口吸管2种方法挑取单克隆细胞。共成功获得156株单克隆细胞，经过PCR和测序鉴定，其中在MSTN基因位点定点整合fat-1基因的细胞系40株，外源基因整合效率为25.64％。
　　3、转基因绒山羊的制备
　　挑选1株阳性细胞通过体细胞核移植技术生产胚胎，共获得249枚胚胎，选择其中的134枚克隆胚移植到56只受体羊中，成功获得1只转基因绒山羊，其生长发育良好，经PCR初步鉴定在MSTN基因位点整合入fat-1外源基因。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分：实验部分

第一章：载体的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4．讨论

参考文献

第二章 CRISPR／Cas9介导MSTN基因敲除同时定点整合外源基因fat-1单克隆细胞的筛选

1．材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 核移植技术制备转基因阿尔巴斯绒山羊

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

结论

第二部分 综述部分 CRISPR／Cas9系统在转基因动物中的研究进展

图版

附录

致谢