基于适配体的赭曲霉毒素和雌激素快速检测方法研究

摘要

核酸适配体是一段可以高亲和力和高特异性结合靶标的单链DNA或RNA，具有尺寸小，稳定性高，容易化学合成及修饰等优点，与多种分析技术相结合，广泛用于食品安全和环境监测分析技术研究。
　　本研究首先结合适配体和试纸条技术，开发了特异性检测赭曲霉毒素A的荧光试纸条，其次基于荧光共振能量转移原理，建立了雌二醇快速灵敏检测方法，最后通过对适配体序列长度对比分析研究，建立了孕酮的纳米金比色快速检测方法。主要研究内容如下
　　1.基于赭曲霉毒素A和适配体互补链竞争性地结合适配体这一原理，选择稳定性好、荧光强度高和发射波长范围广的荧光素Cy5作为信号标记物，建立了用于检测玉米中赭曲霉毒素A的竞争模式的荧光适配体试纸条。该方法定量检测赭曲霉毒素A的有效浓度范围是1ng/mL-1000ng/mL(R2=0972)，检测限为04ng/mL，在玉米样品中的加标回收率为964％-1047％,相对标准偏差为48％-64％,方法具有较好的灵敏度、准确度和稳定性。该研究为谷物中赭曲霉毒素A的检测提供了新型快速的检测技术手段。
　　2.利用荧光基团FAM标记的适配体和淬灭基团BHQ1标记的互补链，基于荧光共振能量转移原理，建立了一种基于适配体的“Turn on”模式的快速检测雌二醇的荧光检测方法。在雌二醇浓度01ng/mL-10μg/mL范围内，线性关系良好(R2=0985)。该方法在实际样品自来水、环境水、尿液和牛奶中的加标回收率分别是980％-1017％、990％-1036％、990％-1025％和1038％-1050％,相对标准偏差分别是28％-38％、39％-54％、54％-90％和103％-143％。该方法实际样品前处理操作简单，仅需过滤、离心即可，并且可以用于三种不同类型的基质中雌二醇的检测，具有良好的稳定性和精确度。本研究为环境和食品中的雌二醇检测提供新的检测手段，也为基于适配体-互补链的检测雌二醇的竞争模式试纸条研究提供了一些研究思路。
　　3.建立了基于不同长度适配体的孕酮的纳米金比色快速检测方法，对比分析了两条适配体亲和力及对纳米金比色法灵敏度的影响。研究结果发现基于25mer适配体方法灵敏度是60mer适配体检测方法的5倍，60mer适配体链过长，适配体与孕酮结合后，冗余的碱基依然吸附在纳米金颗粒表面，降低了响应灵敏度。两个适配体纳米金比色法在各自检测浓度范围内均呈现良好的线性关系（线性相关系数R2＞09），在河水实际样品中加标回收率测定结果良好，且方法的准确度较好(RSD＜65％)。虽然该方法的灵敏度有待提高，但目前基于适配体的孕酮检测方法研究较少，本研究为进一步进行适配体改造，建立更灵敏的孕酮检测方法提供了新的思路。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 核酸适配体

1．2 核酸适配体在赭曲霉毒素A检测中的应用

1．2．1 赭曲霉毒素A

1．2．2 比色法

1．2．3 荧光法

1．2．4 电化学法

1．2．5 试纸条法

1．3 核酸适配体在雌激素检测中的应用

1．3．1 雌激素

1．3．2 纳米金比色法

1．3．3 荧光法

1．3．4 电化学法

1．4 本论文的研究内容与意义

第二章 基于适配体的赭曲霉毒素A试纸条检测技术研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 试剂与材料

2．2．2 主要仪器

2．2．3 适配体及互补链序列

2．2．4 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 适配体浓度优化

2．3．2 缓冲液的优化

2．3．3 灵敏度和线性范围

2．3．4 特异性实验

2．3．5 实际样品加标回收率测

2．4 本章小结

第三章 基于适配体-互补链的雌二醇荧光法检测技术研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 主要仪器

3．2．3 适配体及互补链序列

3．2．4 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 适配体与互补链的摩尔浓度比优化

3．3．2 适配体与互补链的杂交时间优化

3．3．3 适配体与雌二醇的结合时间优化

3．3．4 灵敏度和线性范围

3．3．5 特异性

3．3．6 实际样品加标回收率测定

3．4 本章小结

四章 基于适配体的孕酮纳米金比色法检测技术研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂与材料

4．2．2 主要仪器

4．2．3 适配体及互补链序列

4．2．4 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 氯化钠浓度的优化

4．3．2 适配体浓度的优化

4．3．3 灵敏度和线性范围

4．3．4 特异性

4．3．5 河水样品中检测方法的验证

4．4 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

作者简历