白菜种传黑斑病菌分子鉴定及抑菌药剂初探

摘要

该文以来自国内外的白菜黑斑病菌为研究材料,进行了基本培养条件的比对研究和5.8s rDNA及其侧翼ITS区的克隆、测序、序列变异及系统进化关系的分析,建立了白菜黑斑病菌芸薹链格孢(Alternaria brassicae)、甘蓝链格孢(A.brassicicola)及萝卜链格孢(A.japonica)三个种的分子鉴定方法;根据白菜生产中黑斑病防治的需要,进行了14种杀菌剂抑制黑斑病菌菌丝生长效果的比较研究.试验获得到了以下结果.黑斑病菌及其近缘种真菌核糖体5.8s rDNA及其侧翼ITS区序列比对结果显示,不同种菌株ITS1比ITS2在碱基构成上有更大的变异,而且ITS1的序列长度变异比ITS2的大:而种内虽然各菌株的寄主和地理来源不同,但ITS1和ITS2在长度上均没有变异,碱基构成上存在微小的变异.对该区序列的系统聚类分析表明,白菜黑斑病菌三个种虽然地理来源和寄主不同,但种内的不同菌株均在一个独立的聚类组中,而且和链格孢属内其它种在聚类关系上明显分开,可基于该区进行黑斑病菌的分类鉴定.设计合成了进行白菜黑斑病菌三个种鉴定三对特异性引物,PCR鉴定检测结果表明:Abre1(AGGCTGAAATCTCTCGAGACGA)和Abre2(AAGGCGAGTCTCCAGCAAACTA)引物对能特异性扩增芸薹链格孢的371bp的片段,Abra1(ACCTCAGCAGCATCTGCTGTTG)和Abra2(GGCTTTATGGATGCTGACCTTG)引物对能特异性扩增甘蓝链格孢的457bp片段,Ajap1(AGCAGTGCATTGCTTTACGGCG)和Ajap2(CCAGTAGGCCGGCTGCCAATT)引物对能特异性扩增萝卜链格孢411bp的片段,而且其它近源种未扩增出目标片段,说明这三对引物可以作为白菜黑斑病菌三个种鉴定的分子特征标记.检测表明,PDA是白菜黑斑病菌三个种5个菌株营养生长的最适培养基,菌落直径可以作为区分三个种的参考指标.白菜黑斑病菌三个种芸薹链格孢、甘蓝链格孢和萝卜链格孢菌株最适生长温度20-25℃,甘蓝链格孢和萝卜链格孢菌株菌丝生长温度和原有报道相比提高了5℃;芸薹链格孢中国菌株菌丝生长pH范围为4-8,其它所有供试菌株生长pH为3-11;24h光照、12h光暗交替和24h黑暗对芸薹链格孢中国菌株和萝卜链格孢菌株菌丝生长速率影响不大,其它菌株在24h光照和12h光暗交替下的生长速率比24h黑暗处理的显著增大.14种杀菌剂对白菜黑斑病菌两个优势种芸薹链格孢和甘蓝链格孢国内外株系的生长抑制作用表明:同种但不同来源的病原菌对药剂的敏感性有明显差异,来源相同的不同种菌株对药剂的敏感性也不一致;扑海因、噁醚唑及戊唑醇抑制效果最好,不同菌株对扑海因的敏感性差异不大,EC50为1.2108-2.886μg/ml;该文检测到具内吸作用的戊唑醇和噁醚唑等三唑类杀菌剂能有效抑制白菜黑斑病菌菌丝生长,各菌株对其敏感性差异明显,噁醚唑EC<,50>为0.1275-7.0968μg/ml,戊唑醇EC<,50>为0.7069-4.3574μg/ml.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及学位论文使用授权的说明

第一章白菜种传黑斑病研究进展

1发生与危害

2病菌的分类鉴定

2.1根据显微结构进行分类鉴定

2.2基于侵染机制和生化特点的分类鉴定

2.3同工酶与酶联免疫分析应用于分类鉴定

2.3基于DNA水平的分类鉴定

3种子传带黑斑病菌的检测

3.1传统方法检测

3.2分子生物学方法检测

4核糖体ITS区在病原真菌分类鉴定、检测及系统发育研究中的应用

5白菜种传黑斑病的防治

5.1种子处理

5.2生物防治

5.3植物抗菌活性物质

6本论文的研究内容与技术路线

7本研究的目的与意义

第二章白菜黑斑病菌三个种国内外菌株基本培养条件比较研究

1材料与方法

1.1供试材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1温度对白菜黑斑病菌三个种国内外菌株生长的影响

2.2 pH对白菜黑斑病菌三个种国内外菌株生长的影响

2.3光照对白菜黑斑病菌三个种国内外菌株生长的影响

2.4不同培养基上白菜黑斑病菌三个种国内外菌株菌落特征及生长速率比较

3总结与讨论

第三章黑斑病菌核糖体基因ITS区段测序及同源性分析

1材料和方法

1.1 共试材料

1.2基因组DNA的提取

1.3利用通用引物进行PCR扩增真菌基因组DNA的ITS区

1.4 PCR产物的克隆和测序

1.5目的片段序列测定及序列同源性分析

1.6 ITS1和ITS2区序列聚类分析

2结果与分析

2.1白菜黑斑病菌5.8srDNA及ITS1和ITS2测序及序列变异分析

2.2白菜黑斑病菌5.8srDNA侧翼ITS区序列的遗传进化分析

2.3白菜黑斑病菌5.8srDNA侧翼ITS1和ITS2限制性内切酶位点分析

3结论与讨论

第四章白菜种传黑斑病菌分子鉴定

1材料与方法

1.1供试菌株

1.2试验方法

2结果与分析

2.1特异性引物的设计结果

2.2对芸薹链格孢的PCR鉴定

2.3对甘蓝链格孢的PCR鉴定

2.4对萝卜链格孢的PCR鉴定

3结论和讨论

第五章14种杀菌剂对白菜黑斑病菌的室内毒力测定

1材料与方法

1.1供试药剂

1.2供试菌种

1.3供试培养基

1.4试验方法

2结果与分析

2.1杀菌剂对芸薹链格孢菌中国菌株菌丝生长抑制作用

2.2杀菌剂对芸薹链格孢菌美国菌株菌丝生长抑制作用

2.3杀菌剂对甘蓝链格孢中国菌株菌丝生长抑制作用

2.4杀菌剂对甘蓝链格孢美国菌株菌丝生长抑制作用

2.5供试杀菌剂对黑斑病菌不同菌株的EC50(单位：μg/ml)比较

3结论与讨论

第六章总结与讨论

1总结

2讨论

参考文献

致 谢