犬细小病毒的基因组克隆和生物学特性研究及狂犬病病毒N基因的原核表达

摘要

本论文包括两部分：1)犬细小病毒(CPV)基因组克隆和生物学特性研究；2)狂犬病病毒N基因的原核表达及应用第一部分： 犬细小病毒病由犬细小病毒(CPV)引起，临床症状以出血性肠炎和心肌炎为特征，是目前威胁养犬业的主要传染病。犬细小病毒是一种线性单链DNA病毒，全长基因组为5323bp，由两个开放的读码框编码2个结构蛋白和2个非结构蛋白，为自主复制的细小病毒。 本研究首先从发病犬的粪便中分离获得了一株北京地区2004年流行的CPV病毒株，命名为CPV-B2004，根据Genbank已发表序列设计引物，采用分段PCR的方法获得该病毒的两个基因片段，并克隆到pMD-T18载体，分别命名为pMD-CPV/2132和pMD-CPV/2925，连接这两个DNA片段构建包含几乎全长基因组的克隆，命名为pMD-CPV/4623，进行序列测定。基因组序列分析显示该分离株B2004与Genbank发表序列的核苷酸序列相似性大于99.3％，与欧洲(新西兰)的分离株遗传关系最近；分析NS1及VP1的DNA核苷酸序列和蛋白氨基酸序列显示了相同的特点：而且与编码非结构蛋白读码框的核苷酸序列相比，编码结构蛋白的读码框核苷酸序列变异较大。与CPV-d和CPV-b(1979)完全基因组序列比对，除了在编码区特别是结构蛋白存在一些变异外，3′端非编码区在266位缺失了aacc四个碱基；5′端非编码区4554-4616位(与全长的基因组CPV-d相对应)缺失了62bp的重复序列，4765-4890丢失了125bp的重复序列，即两个62bp的重复序列。根据VP2的氨基酸序列分析，与已有的标准CPV基因型比较发现，该毒株426位氨基酸为Asn，555位氨基酸残基为Val，为目前流行的CPV-2a型：分析VP2的核苷酸序列和氨基酸序列同样得出，CPV-B2004与台湾和欧洲的CPV-2a遗传关系较近，属于同一个分枝。 为了研究该病毒结构蛋白的细胞定位，构建了表达VPl N端区和VP2基因的真核表达质粒pEGFP-vp1和pEGFP-vp2，转染细胞48h后激光共聚焦显微镜(LSM510，Zeiss)下观察GFP的表达，了解病毒衣壳蛋白的核运输功能。转染pEGFP-c1载体的细胞，荧光表达量大，且仅存在于细胞质；而转染pEGFP-vp1的细胞荧光表达主要集中于细胞核，也有部分显示在细胞核的边缘：转染pEGFP-vp2的细胞荧光表达则在细胞质和细胞核中分散分布。这些结果表明重组了VPl N端11个氨基酸残基(MAPPAKRARRG)的pEGFP-vp1主要在细胞核产生荧光，这11个氨基酸是较强的核定位序列，能够运送锚钉蛋白质进入细胞核：进而证明了VP1 N端单一区的核定位功能。而携带了GFP的VP2没有足够强的核运输功能，把GFP全部运输到细胞核。 为了进一步了解CPV的生物学特点，观察了CPV的感染过程，激光共聚焦显微镜下观察病毒接种细胞后4—48h的CPV病毒粒子的亚细胞定位，病毒在接种细胞8h内位于细胞质；8—12h进入细胞核，开始复制，约16h在细胞核内积累大量病毒粒子，24h后出现在细胞质，32—48h充满于整个细胞。通过激光共聚焦研究转铁蛋白受体和CPV进入的关系表明，CPV与转铁蛋白使用相同的受体进入细胞，并且在进入后2h共定位于细胞核周质；制备不同组织的原代细胞，接种CPV和Tf孵育发现，TfR是CPV病毒组织特异性的原因，但也有其它因素影响CPV在不同组织细胞的复制。根据获得序列设计4对SiRNA寡聚核苷酸，构建psiSTRIKE系列的U6发卡结构载体，研究质粒介导的siRNA对CPV病毒复制的影响。结果显示，分别以CPV的核衣壳蛋白基因和非结构蛋白基因为靶基因，选择的4段21nt的保守序列，构建了小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)的psiSTRIKE表达载体，并转染FK81细胞筛选稳定的转染细胞，通过病毒感染检测、细胞活度测定和TCID<,50>)测定，发现该种方法介导的shRNA表达质粒能抑制CPV病毒在细胞内的复制和感染，具有抗病毒作用，但不能完全阻断病毒的感染。第二部分： 狂犬病是由狂犬病毒引起的中枢神经系统的人兽共患传染病，一旦发病无法救治，100％死亡。狗是最主要的宿主，而且也是感染人与其它动物的主要传播媒介；目前尚无有效的治疗方法，疫苗接种是预防狂犬病的唯一有效途径。家养和野生动物接种疫苗并保持较高的抗体水平是预防和控制狂犬病的最有效途径，因而对家养和野生动物狂犬病免疫后中和抗体效价的监测就显得尤为重要。以本实验室已构建和保存的质粒pGEM-T/NP(CTN)为基础，将N基因亚克隆到表达载体pMAL-c2x中，构建了原核表达质粒pMal-NP，转化大肠杆菌JM109细胞诱导其表达。Western印迹和ELISA验证了表达纯化的MBP-NP融合蛋白的抗原性和免疫原性。利用此融合蛋白作为包被抗原，构建了一个检测血清中抗狂犬病抗体水平的间接ELISA检测体系，通过测定标准阴性血清、阳性血清和采自免疫接种过狂犬病疫苗的犬科动物的抗体水平，表明该EIJSA方法敏感性高，特异性好。测定样品ELISA的OD值与标准方法RFFIT。测得的中和抗体滴度两者具有很高的相关性(r=0.9436)。安全方便的重组MBP-NP融合蛋白能够用于检测犬科动物的抗狂犬病抗体水平和免疫原。

目录

文摘

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论文说明：主要缩写词一览表

声明

第一部分犬细小病毒的基因组克隆和生物学特性研究

第一节文献综述

第二节犬细小病毒基因组的克隆

1立题意义

2材料和方法

3结果

4讨论：

5小结

第三节结构蛋白的亚细胞定位研究

1立题意义

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结：

第四节转铁蛋白受体与犬细小病毒的侵入和细胞组织嗜性的关系

1立题依据

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结

第五节siRNA干扰对CPV病毒复制的影响

1立题意义

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结

参考文献

第二部分狂犬病病毒N基因的原核表达及其应用

第一节狂犬病病毒N基因的研究进展

1狂犬病病毒概述

2核蛋白(Nucleoprotein，NP)

第二节在原核劝胞中表达狂犬病病毒N基因作为诊断抗原

1立题意义

1材料和方法

3结果

4讨论

5小结

参考文献

致谢

作者简介

附录