狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆，以及一种通过反向遗传技术拯救出具有活性狂犬病毒的方法。本发明利用CTN株狂犬病毒全长基因组内的单一限制性酶切位点将病毒全长分成四段进行扩增，同时用绿色荧光蛋白基因代替伪基因处423bp碱基，克隆入pVAX－R表达载体，构建成病毒基因组重组全长质粒。用PCR扩增CTN株狂犬病毒的核蛋白，磷蛋白，糖蛋白，转录大蛋白基因序列，并将扩增片段克隆入pVAX1载体中，构成反向遗传系统中的4个辅助质粒。将这5个质粒共同转染细胞，拯救狂犬病病毒。本发明成功拯救出狂犬病毒，对研究狂犬病毒的致病机理，新型疫苗的研制以及病毒载体等方面具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种狂犬病毒，更具体地说是利用反向遗传技术拯救重组狂犬病毒，属于生物工程领域。

背景技术

狂犬病(RV)是由狂犬病毒引起的一种人畜共患病，病死率几乎高达100％。该病流行于100多个国家和地区，全世界每年因狂犬病死亡的人数达55000人，印度是狂犬病流行最严重的国家，其死亡人数占一半；中国的狂犬病例数仅次于印度，占世界第二位。狂犬病毒具有神经嗜性，在动物机体内的感染可以分为向心性扩散和离心性扩散两个过程。前者即病毒从入侵部位通过神经-肌肉接头或神经传感器侵入外周神经，再沿脊髓到达中枢神经系统，导致脑脊髓炎；后者即离心性扩散，是病毒从中枢神经向周围神经系统扩散，导致临近某些非神经系统的感染，特别是受神经系统高度支配的器官，因此最终不可避免地发展为全身神经系统的衰竭和死亡，具体的致病机理尚不明确。

反向遗传技术是20世纪末新兴起来的一种技术，即从克隆的质粒中拯救出具有感染活性的病毒。此技术可以用于制造弱毒活疫苗用于野生动物的免疫，效果很好，在欧美国家应用较多，所以在这些国家野生动物狂犬病得到了很好的控制。1994年，Schell等首次建立了狂犬病毒的反向遗传学，成功拯救了SADB19株狂犬病毒，此后相继用此方法成功拯救出其他两株RC-HL，HEP-Flory和ERA株狂犬病毒。

目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法，免疫接种疫苗是预防狂犬病的最有效措施之一。现有的狂犬病毒疫苗主要是灭活疫苗，用于人的免疫，对于动物的免疫或者野生动物的免疫依然存在漏洞和不足，由于灭活疫苗为注射型疫苗，对于野生散养动物的免疫并不实用，而且面临动物疫苗生产成本高，用于野生动物免疫费用昂贵等问题。

在反向遗传系统中，获得基因组转录后精确的5’和3’末端是通过在其全长基因组3’和5’末端添加具有自我切割活性的HamRz和HdvRz实现的。而狂犬病病毒全长基因组有12kb，不可能一次完成扩增，所以全长基因的扩增都采用分段扩增的方法。预在基因组cDNA的5’端加入锤头状核酶序列，就将锤头状核酶序列直接设计在第一个基因片段的上游引物中；同样，预将丁型肝炎核酶序列添加在基因组cDNA序列的3’末端，就将丁型肝炎核酶的序列设计在最后一个基因片段的下游引物中。

这种设计必然存在一些问题。首先，HamRz和HdvRz的活性中心最小结构分别包括45nt和85nt，这么长的引物必会造成上下游引物长度不匹配；引物之间GC％失调；引物之间二聚体、发夹结构不可避免；其次，由于上下游引物长度的差距，很难找到合适的退火温度，PCR反应条件也难于优化。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆。

本发明的另一目的是提供一种上述狂犬病毒cDNA克隆的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述方法中使用的扩增引物及表达载体。

为了实现上述目的，本发明思路为：

本发明利用CTN株狂犬病病毒全长基因组内的单一限制性酶切位点将病毒全长分成四段进行扩增，在扩增同时去除伪基因处423bp碱基，代之以绿色荧光蛋白基因，最后克隆入pVAX-R表达载体，载体序列如SEQ ID No.24所示；构建成病毒基因组全长质粒。pVAX-R载体为pVAX1载体的改造体，即将pVAX1载体的多克隆酶切位点处切除，代之以锤头状核酶、由9个限制性酶切位点组成的linker、丁型肝炎核酶序列。另外，用RT-PCR扩增CTN株狂犬病病毒的核蛋白(N)，磷蛋白(P)，糖蛋白(G)，转录大蛋白(L)基因序列，并将扩增片段直接克隆入pVAX1载体中，构成反向遗传系统中的4个辅助质粒。最后将这5个质粒共同转染BHK-21细胞，最终拯救狂犬病病毒，得到狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆。

CTN株狂犬病病毒全长基因组包括11923个核苷酸，(Genbank编号EF564174)本发明的具体技术方案为：

狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆，该cDNA克隆的核酸序列为SEQ IDNo.1所示。

一种狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆的制备方法，其包括下列步骤：(1)利用CTN株狂犬病病毒全长基因组内的单一限制性酶切位点将病毒全长分成四段进行扩增，在扩增同时去除伪基因处423bp碱基，代之以绿色荧光蛋白基因，最后克隆入pVAX-R表达载体，载体序列如SEQ ID No.24所示；构建成病毒基因组全长质粒；(2)用RT-PCR扩增CTN株狂犬病病毒的核蛋白、磷蛋白、糖蛋白和转录大蛋白基因序列，并将扩增片段直接克隆入pVAX1载体中，构成反向遗传系统中的4个辅助质粒；(3)将上述5个质粒共同转染细胞，最终获得狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆。

上述PVAX-R表达载体的构建方法为将pVAX1载体的多克隆酶切位点处切除，代之以锤头状核酶、由9个限制性酶切位点组成的linker和丁型肝炎核酶序列。所述PVAX-R表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。

Linker的合成过程：

为了便于病毒全长cDNA的克隆，设计一个linker将连接基因组片段所需的限制性内切酶按顺序依次排列。Linker cDNA序列为：linker-F：5’-CTGAATTCTGCGCGCTGGCGCGCCTGCTAGCTGTTTAAACTCTGCAGTGGGCCCTTGC-3’，linker-R：5’-GGCCGCAAGGGCCCACTGCAGAGTTTAAACAGCTAGCAGGCGCGCCAGCGCGCAGAATTCAGGTAC-3’。划线部分为KDn I，EcoR I，BssH II，Asc I，Nhe I，Pme I，PstI，Apa I，Not I酶切位点，这两条寡聚核苷酸链有上海生物工程公司合成，将这两个寡聚核苷酸链直接退火形成双连结构后克隆于pVAX1载体中KpnI/Not I位置。由此在pVAX1载体的CMV启动子下游依次连接着HamRz，含有9个限制性酶切位点的linker和HdvRz cDNA序列，将改造后的载体命名为pVAX-R。

pVAX-R载体为pVAX1载体的改造体，为克服现有技术的的不足并结合HamRz和HdvRz各自的结构特点，本发明载体的构建中在锤头型核酶的螺旋III区内引入KpnI限制性酶切位点，将此位点至核酶5’端的cDNA序列人工合成，形成双链，直接克隆到表达载体中。而KpnI酶切位点至HamRz3’端的cDNA序列(大概10nt左右)直接设计在第一个基因片段的上游引物中，通过PCR反应直接扩增获得。这样在KpnI限制性酶切位点处形成一个连接位点，将HamRz和基因组cDNA5’末端连接在一起，并且使基因组cDNA5’末端序列直接位于切点处，转录后产生精确的基因组5’末端，没有任何额外序列。按照同样的方法，根据这种HdvRz的结构特点，在HdvRz的J1/2区引入一个NotI切点，将HdvRz分成两个部分，NotI切点至HdvRz3’末端的cDNA序列人工合成后，直接克隆到连有HamRz的pVAX1载体中，而Not I切点至HdvRz5’末端的这段cDNA序列添加到F4的下游引物中，通过F4段的PCR扩增得到，这样NotI就成为连接基因组cDNA3’末端序列和HdvRz的连接点，使基因组cDNA3’末端位于HdvRz的切点位置，转录后产生3’末端无多余序列的基因RNA。

上述步骤(1)中扩增引物序列为SEQ ID No.2至SEQ ID No.9所示，共4个引物对。

所述核蛋白的扩增引物为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；所述磷蛋白的扩增引物为SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示；所述糖蛋白的扩增引物为SEQID No.14和SEQ ID No.15所示；所述转录大蛋白的扩增引物为SEQ ID No.16和SEQ ID No.23所示。

上述的狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆的扩增引物，其中，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2至SEQ ID No.23所示。

本发明用途：

本发明狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆在制备狂犬病疫苗中的应用或作为病毒载体的应用。

本发明的优点及有益效果：

现有技术无法直接将CTN株狂犬病病毒进行改造，使其可以加入外源性功能蛋白进行功能上的扩展。本发明使用反向遗传技术并通过对载体的构建使重组狂犬病病毒从克隆的质粒中获得拯救获得狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆。本发明的优点在于本发明获得的狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆保存其原有病毒的弱毒性，具有安全性，并且可以对其在RNA水平上进行加工和修饰、基因的替换和删除、外源基因的插入等一系列改变，功能性更强大，应用范围更广泛，可以用来制备新型狂犬病疫苗如野生动物口服疫苗等或做为病毒载体使用。本发明可以进一步用来研究狂犬病病毒的致病机理、中国狂犬病持续流行的分子机制等。因此，本发明极具开发应用价值和市场前景。

本发明将绿色荧光蛋白插入CTN株狂犬病病毒全长基因组内构建全长质粒，通过狂犬病病毒的反向遗传技术，最终才能够克隆cDNA质粒中拯救出具有活性的狂犬病病毒，此病毒能够稳定表达绿色荧光蛋白基因，最终确定重组病毒是否拯救成功时，只需在荧光显微镜下观察是否可见绿色荧光蛋白的表达即可得知。无需像现有技术一样利用抗体等技术进行确认。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，以使本领域技术人员可以更清楚的得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

附图说明

图1为真核表达载体pVAX1和本发明构建的pVAX-R载体图谱。

具体实施方式

实施例1 狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆的构建方法

(1)病毒：

CTN株狂犬病病毒的亲代病毒是1953年从山东省淄博市一个感染了狂犬病病毒病人的脑组织中分离得到的，将分离到的病毒在鼠脑中连续传代56代，随后在人二倍体细胞(BMK-17)上继续传代50代得到的狂犬病病毒减毒疫苗株，并于1983年和2005被世界卫生组织(WHO)获批作为中国狂犬病疫苗生产用毒株。此病毒株由中国药品生物制品检定所保存并提供。

(1)病毒RNA的提取：

取少量冻干的带毒鼠脑，先加入0.2ml TRIzol Reagent(Invitrogen公司)研磨成匀浆后，再加入0.8mlTRIzol Reagent(Invitrogen公司)。混匀，在-20℃冰箱中放置30min，加200μl氯仿，快速颠倒充分混匀，室温放置5min，4℃离心，12000rpm离心15min，取离心后上层水相加入新1.5ml 1.5ml离心管中，每管加入与上清等体积的异丙醇，轻柔混合，室温放置10min，4℃12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀，加入1ml 75％新配制的冰预冷的乙醇，振荡洗涤，4℃12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥沉淀，后将沉淀溶于70μl无核酸酶的超纯水中。

(2)病毒RNA的逆转录：

将随机引物Pd(N)6稀释至0.2μg/μl，将水浴箱预热至65℃，吸取33μl总RNA液加入1.5ml离心管中，放入65℃中水浴10min，取出后立即冰浴2min，瞬时离心，将32μl液体转移至Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads(AMERSHAM公司)反应管中，再向反应管中加入1μl随机引物Pd(N)6(0.2μg/μl)，使总体积达到33μl，室温1min，混匀，瞬时离心，37℃水浴60min，即得逆转录产物cDNA。

(3)病毒基因序列扩增引物的设计与合成：

根据CTN株病毒序列，选择基因组中两个单一酶切位点作为分界点将病毒全长基因分成4段(F1，F2，F3，F4)进行扩增，扩增同时去除了伪基因处423bp碱基代之以绿色荧光蛋白(GFP)基因，扩增的引物如表1所示：

表1

 

          序列表序号    引物                 引物序列(5’-3’)目的片段长          度(bp)    SEQ ID No.2F1F-Kpn IGGTACCCTATAGTCACGCTTAACAACCAAATC    3019         SEQ ID No.3         F1R-EcoRI                            CCGGAATTCATGTTGATACACCATACCCSEQ ID No.4F2F-EcoRIGATCCGCGCGGGGCGTGGTGTATCAACATGAATTCTAGAAC    1921SEQ ID No.5F2R-BssHI IGCGCGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGGAGATGACCTGCCSEQ ID No.6F3F-Nhe IGCTAGCAACACTTCTCATCTTGAAACTC    3613SEQ ID No.7F3R-ApaIGTGAGAGGGCCCTTTTTACTACATGSEQ ID No.8F4F-ApaIGCCGGCGGCGGGGCCCTCTCACTAAAAGAATCTATAAA    2943SEQ ID No.9F4R-Not IGCGGCCGCTCCGACCCACGCTTAACAAAAAGACCATAA

“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。下划线部分为引物中所带的限制性酶切位点。

此外，根据N、P、G基因的序列，分别设计了三对特异性引物扩增这三个基因。对于L基因，由于基因过长，很难一次性扩增成功，所以利用L基因内的单一酶切位点将L基因分成4段进行扩增，设计4对特异性引物，每个引物扩增片段不超过2kb，再将其拼接起来构成完整的L基因。

N、P、G、L各个基因扩增的特异性引物如表2所示：

表2

 

序列表序号引物引物序列(5’-3’)目的片段长度(bp)        SEQ ID No.10SEQ ID No.11N-FN-RGCTAGCAATGGATGCCGACAAG    CTTAAGTTACGAGTCACTAGAGTACG1353SEQ ID No.12SEQ ID No.13P-FP-RGCTAGCGATGAGCAAGATCTTCG  AAGCTTGTCAGCAAGATGTATAACG894SEQ ID No.14SEQ ID No.15G-FG-RGCTAGCATGATTCCTCAAGCTCTGCTTAAGTTACAGCTTGGTCTCACC1575

 

SEQ ID No.16SEQ ID No.17SEQ ID No.18SEQ ID No.19SEQ ID No.20SEQ ID No.21SEQ ID No.22SEQ ID No.23L1-FL1-RL2-FL2-RL3-FL3-RL4-FL4-RGGGGTACCATGATGATTGATCCAGGACGCGTCGACTCTGACCGTTGAT  GGACGCGTCGACAGAAGATGTATTTCCATCGATCCATGGATCTCTGAGTTCATGCCATGGAATCAACCGGA    ACCCAAGCTTGGCATCTGGAAAC  TCCAGATGCCAAGCTTGTATTC   GGAATTCTCATAAGCAGCTGTAGTC1907    1355    1956    1238

“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。(4)目的基因的PCR扩增：

①将全基因分为4个片段分别扩增并直接测序：在0.2ml离心管中加入以下试剂进行PCR反应：双蒸水34.5ul，10×Easy-A Buffer 5ul，10mM dNTP mix 1.5ul，Primer-F 1.5ul，Primer-R 1.5ul，cDNA 5ul，Easy-A High-Fidelity PCR CloningEnzyme & Master Mix(Stratagene公司)1ul。4个片段PCR程序循环如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，对4个片段而言58℃，68℃，58℃，66℃分别退火40s，72℃延伸40s，72℃总延伸10min，共30个循环。②辅助质粒的扩增：辅助质粒PCR反应体系同全长质粒分段扩增的PCR体系完全相同，PCR反应条件分别为，N，P，G和L基因的各个片段的PCR反应条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 1min，72℃2min30s，72℃10min。

(5)目的基因片段的回收：

使用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。在长波紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。切碎胶块。将胶块放入一个无色离心管中，称其重量(100mg～100μl)。加3倍胶块体积的Buffer QG，50℃水浴10min(或直到胶块完全溶解)。可以每隔2-3min震荡离心管以助溶解。胶块完全溶解后，混合物应该为黄色(如同没溶解胶之前Buffer QG的颜色)，将QIAquick spin column放置于2ml收集管上，小心将溶液转移到QIAquickcolumn中，使DNA结合到膜上，13000rpm离心1min，弃滤液，将QIAquick column再放回同一收集管中，加0.75ml Buffer PE，洗结合到膜上的DNA。弃滤液，13000rpm再离心1min，将QIAquick放入干净的1.5ml离心管中，加30μl的洗脱液到QIAquick膜的中心部位，并静置1min，然后13000rpm离心1min，该试剂盒购自QIAgen公司。

(6)目的基因片段连接T载体：

将回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体连接，取纯化的PCR产物5ul，10×T4 DNAbuffer lul，T4 DNA连接酶1ul，pGEM-T Easy ectorlul，灭菌双蒸水2ul，16℃连接过夜。

(7)转化：

取连接产物5ul转化到100ul E.coli JM109感受态细胞中(TAKARA公司)，37℃180rpm/min复苏1.5h，取200ul菌液涂于含50ug/ul的氨苄青霉素和适量IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚—β-半乳糖苷)琼脂平板上，37℃培养12-16h，进行蓝白斑筛选。(8)PCR鉴定：

挑取白色菌落，用PCR扩增用的特异性引物进行菌落PCR鉴定，PCR体系和条件同PCR扩增时所用。

(9)小量提取质粒：

将过夜培养的细菌培养液1ml置于1个1.5ml离心管里，4℃ 13000rpm离心1min，弃掉上清，加入250ul试剂盒里预冷的溶液P1吹打溶解细菌沉淀，加入250ul溶液P2，轻柔的颠倒混匀，再加入350ul溶液P3，颠倒混匀出现絮状沉淀后，4℃ 12000rpm离心10min，立即吸取上清于2mlQIAGEN-tip中，4℃ 12000rpm离心1min，弃掉液体，加入500ul溶液PB洗脱，12000rpm离心1min，弃掉液体，加入750ul溶液PE洗脱，12000rpm离心1min，弃掉液体，空离1min，加入30ul TEbuffer，12000rpm离心1min，洗脱液即为所需质粒。

(10)酶切鉴定：

选择适当的酶切位点对连接在T载体上的各个片段进行鉴定。取小提质粒2ul，10×bufferlul，相应的内切酶0.5ul，双蒸水补至10ul，37℃水浴1h，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。各个片段鉴定所用限制性内切酶及鉴定后的目的片段如下，F1-T：DraI(2490bp，1818bp，692bp)；F2-T：PvuI(1096bp，3825bp)；F3-T BamHI(1097，1657，2877)；F4-THindIII/MluI(1642，4301)；N-T：NheI/AflII(1353bp，3000bp)；P-T：NheI/HindIII(894bp，3000bp)；G-T：NheI/AflII(1575bp，3000bp)；L1-T：KpnI/SalI(1900bp，3000bp)；L2-T：SalI/NcoI(1350bp，3000bp)；L3-T：NcoI/HindIII(1950bp，3000bp)；L4-T：HindIII/EcoRI(1250bp，3000bp)。

(11)序列测定：

将TA克隆鉴定正确的样本，送北京博迈德科技发展有限公司测序。用pGEM-TEasy载体上的通用引物进行测序，筛选出正确的TA克隆质粒备用。

(12)表达载体的改造：

将pVAX1载体用NheI/KpnI，KpnI/NotI，NotI/PmeI分别双切，同时将HamRz，linker，HdvRz合成的寡聚核苷酸稀释至工作浓度100℃煮沸后，室温退火5min，将这些寡聚核苷酸分别连接于pVAX1上构成pVAX-R表达载体。具体方法同(10)。

(13)全长质粒构建：

用酶切连接的方法，将F1，F2，F3，F4依次连接在pVAX-R载体上，同时选择pGFP作为绿色荧光蛋白基因(GFP)的供体，在GFP基因的5’和3’段分别插入两个linker，使GFP基因3’和5’两端分别带有狂犬病病毒转录起始和终止信号。具体连接和转化方法如下：线性化的pVAX-R载体3ul，10×T4 buffer 1ul，相应的酶切片段5.5ul，T4 DNA连接酶0.5ul，16℃连接过夜。将连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，取200ul复苏的感受态细胞菌液涂于含50ug/ul的卡那LB平板上，挑取克隆进行PCR和酶切鉴定。

(14)辅助质粒构建：

用相应的酶将N，P，G，L1，L2，L3，L4分别从T载体中酶切消化下来，方法同(10)，再将其克隆入pVAX1载体中，具体连接方法如下：线性化的pVAX1(Invitrogen)载体3ul，10×T4 buffer 1ul，相应的酶切片段5.5ul，T4 DNA连接酶(NEB)0.5ul，16℃连接过夜。将连接产物转化E.coliJM109(TAKARA)感受态细胞，取200ul复苏的感受态细胞菌液涂于含50ug/ul的卡那LB平板上，挑取克隆进行PCR和酶切鉴定。

(15)大量提取质粒：

QIAGEN Plasmid Maxi Kit提纯方法：将1个锥形瓶里过夜培养的细菌培养液150ml置于1个50ml离心管里，4℃ 6000g离心15min，分三次离心收集细菌。加入10ml溶液P1重悬细菌；加入10m溶液P2，上下颠倒轻柔混匀，室温孵育5min；再加入10ml预冷的溶液P3，轻柔颠倒混匀4-6次，将混合液体倒入QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min；同时，用10ml溶液QBT平衡QIAGEN-tip500柱，流干后，将注射器内芯轻柔插入注射器内，将流出的液体收集至平衡过的QIAGEN-tip500柱内，待液体流干后，用60ml溶液QC洗涤柱，将QIAGEN-tip500柱放置另1个50ml离心管里，用15ml溶液QF洗脱DNA，加10.5ml(0.7体积)的室温异丙醇到洗脱液里，室温孵育5min，同时将QIAprecipitator Maxi Module置于30ml注射器的管口，将孵育后的洗脱混合液倒入注射器内，插上注射器内芯，让洗脱液在压力作用下缓缓流出，加入2ml70％的无水乙醇洗脱QIAprecipitator，再把内芯拔出，推一管空气使残余的无水乙醇排出，将QIAprecipitator置于一个5ml注射器管口，加入500ul TE，收集洗脱的液体，即为含有DNA质粒。

(16)转染：

将大量提取的病毒全长质粒和4个辅助质粒，按照全长质粒2ug，N蛋白辅助质粒0.5ug，P蛋白辅助质粒0.25ug，G蛋白质粒0.15ug和L蛋白辅助质粒0.1ug的量

共同转染BHK-21细胞。转染前16h用消化好的BHK-21细胞接种6孔板，待细胞长成单层，密度大概在80％左右，用无血清无双抗(双无)的DMEM(Gibco)洗涤细胞2次，在孔中加入1ml的双无DMEM待用；10ul Lipofectamine^TM 2000 TransfectionReagent(Invitrogen)加入50ul双无的DMEM中，室温孵育5min，同时将5种质粒加入50ul双无DMEM中，室温孵育5min；将DNA稀释液和脂质体稀释液轻柔混合，室温孵育20min，整个孵育时间不能超过25min。将孵育完的混合液加入洗好的6孔板中，6h后，弃掉细胞上清液，换成含10％血清，1％双抗的DMEM液，16-24h后换液一次，之后培养2-5d。

(17)结果观察：

将转染5天后的细胞，弃掉上清，直接放在荧光显微镜下观察，可见绿色荧光蛋白的表达，用TRizol法提取上清总RNA，经反转录后，用一对跨GFP和L基因的特异性引物进行扩增，PCR结果为阳性，证明重组病毒拯救成功。

实施例2本发明所述狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆弱毒性动物实验例

选择10只3日龄的昆明鼠乳鼠，10只10日龄的小鼠和10只20日龄的成年鼠进行动物攻毒实验。

一、实验方法：

1.用本发明拯救后的重组病毒通过脑内注射的途径接种同时接种20日龄成年鼠和1日龄乳鼠，重组狂犬病滴度为8.9×10⁴ffu/ml以20ul/只的剂量脑内注射1日龄昆明鼠乳鼠，以25ul/只的剂量脑内注射10日龄昆明鼠乳鼠并以30ul/只的剂量脑内注射20日龄成年昆明鼠。

二、实验结果：

接种5天后，3日龄组的乳鼠开始出现神经症状，对外界刺激反应敏感，并且后肢开始出现麻痹症状，出现神经症状3-4天后，乳鼠全部死亡。取死亡乳鼠脑组织，制作冷冻切片段，在共聚焦显微镜下发现脑组织海马回处有大量荧光蛋白的表达，说明乳鼠是感染了重组的狂犬病病毒而致死。而10日龄组和20日龄组小鼠鼠注射此重组病毒后，15天内均没有发病。并且取未发病的鼠脑组织同样制作冰冻切点，在共聚焦显微镜下未观察到有绿色荧光蛋白的表达。说明10日龄组和20日龄组小鼠没有感染此重组的狂犬病病毒。

通过以上动物实验表明，本发明重组的狂犬病病毒只对3日龄的乳鼠才具有毒性，对10日龄以上的小鼠没有致病性。本发明重组的狂犬病病毒保留了与原有CTN株原始病毒一样的弱毒性，具有安全性。

本发明应用：

本发明可以用于制备新型狂犬病疫苗，如G蛋白是狂犬病病毒的包膜蛋白，它是唯一一个能刺激机体产生中和抗体的蛋白。由此，可以在本发明获得的狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆G，L蛋白之间再插入一个G蛋白，后插入的G蛋白可以是CTN株的G蛋白，也可以是其它疫苗株的G蛋白，这样构成一个双G蛋白表达体系，通过反向遗传技术，将含有双G蛋白的重组病毒拯救成功。糖蛋白表达量的增加必然会刺激机体产生更强的免疫保护作用从而制备成新的疫苗。也可在本发明绿色荧光蛋白处插入其他功能蛋白，将本发明作为病毒载体使用。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆

<160>24

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>12263

<212>DNA

<213>狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆

<400>1

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>F1F-Kpn I人工序列

<400>2

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>F1R-EcoRI人工序列

<400>3

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>F2F-EcoRI人工序列

<400>4

<210>5

<211>43

<212>DNA

<213>F2R-BssHII人工序列

<400>5

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>F3F-Nhe I人工序列

<400>6

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>F3R-ApaI人工序列

<400>7

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>F4F-ApaI人工序列

<400>8

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>F4R-NotI人工序列

<400>9

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>N-F人工序列

<400>10

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>N-R人工序列

<400>11

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>P-F人工序列

<400>12

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>P-R人工序列

<400>13

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>G-F人工序列

<400>14

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>G-R人工序列

<400>15

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>L1-F人工序列

<400>16

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>L1-R人工序列

<400>17

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>L2-F人工序列

<400>18

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>L2-R人工序列

<400>19

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>L3-F人工序列

<400>20

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>L3-R人工序列

<400>21

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>L4-F人工序列

<400>22

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>L4-R人工序列

<400>23

<210>24

<211>3078

<212>DNA

<213>pVAX-R载体人工序列

<400>24