水生拉恩氏菌HX2细菌素合成相关基因分析和皱褶假单胞菌P94初步研究

摘要

Rahnella aquatilis HX2产生细菌素，对多种植物病原细菌具有平板抑制效果，具有较广泛的抑菌谱；温室和大田实验显示HX2菌株对由A.vitis K308引起的葡萄根癌病有较好的防治效果。本研究在前人研究的基础上系统研究了HX2细菌素合成相关基因及细菌素在HX2防治葡萄根癌病生防机理中的作用。
　　 通过Tn5插入突变获得两株不产生细菌素的突变体MH15和MH16，Southern杂交表明Tn5在MH15和MH16中都是单拷贝插入。Tn5插入引起HX2细菌素产生性状缺失，并对菌株的生长也发生了影响，两个突变体在生长曲线的对数生长期与野生菌株没有差异，但稳定期明显长于野生菌株，使得突变体菌落直径在生长40 h后约为野生菌株的两倍。
　　 构建了HX2基因组文库。利用鸟枪法和反向PCR法分别通过突变体MH15和MH16中克隆到了Tn5插入的侧翼序列，通过侧翼序列设计引物对构建的基因组文库进行筛选，将筛选到的阳性粘粒通过三亲杂交验证功能表明筛选到的阳性粘粒都能互补突变体，使突变体产生细菌素的能力得到恢复。将获得的阳性粘粒进行亚克隆获得2400 bp的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)可以互补突变体MH16。从阳性粘粒中获得一个辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇(包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF六个PQQ合成基因(长5374 bp)和一个1038 bp的未知功能的阅读框ORF-X)可以互补突变体MH15。构建了gdh基因缺失载体，HX2的gdh基因缺失菌株HX2Δgdh细菌素产生的性状同时缺失。构建了gdh和Pqq基因互补载体，通过三亲杂交转入突变体后都能使突变体产生细菌素的性状得到恢复，并且突变体生长性状也恢复到了野生菌的水平。将PQQ以0.01μM加入到培养基中也可以使MH15产生细菌素和生长的性状恢复到野生菌HX2水平。这些结果表明gdh基因和Pqq基因簇与HX2细菌素合成有关。
　　 温室检测突变体和互补菌株在向日葵和葡萄上对A.vitis引起的根癌病的防治效果，实验结果表明，不产生细菌素的菌株(MH15、MH16)在向日葵上对根癌病的防效为28.8～33.3％，在葡萄上对根癌病的防效为77.4～82.1％，产生细菌素的菌株(HX2、CH15、CH16和MH15+PQQ)在向日葵和葡萄上对根癌病的防效没有差异，为92.3～100％；大田防效检测结果表明，产素缺失突变体对葡萄根癌病的防效由野生菌株(HX2)的80.2％下降到了45.1％(MH15)和55.7％(MH16)；产素缺失突变体在葡萄上对A.vitis K308引起的根癌病的防效要优于在向日葵上对其的防效。这些结果表明细菌素在HX2生防机理中占有重要作用，但并不是其唯一机理。
　　 从北京地区土壤中分离出628株细菌，从中筛选出10株对番茄灰霉病菌有拮抗作用的细菌，其中P94的拮抗能力最强。生防菌株P94的抑菌谱实验结果表明P94对多种植物病原细菌和病原真菌有抑制作用。P94在向日葵、番茄和烟草上无致病性。通过Biolog鉴定系统，16S rDNA序列测定，生理生化特征，将生防菌株P94鉴定为皱褶假单胞Pseudomonas corrugata。用两对特异性引物将P94鉴定为P.corrugata基因群Ⅱ。生防菌株P94在番茄叶片上对灰霉病的防效达55.3％。与生防相关的HCN、IAA、磷酸脂酶、蛋白酶等性状在P94生防菌株上表现阳性，说明其生防机理与抑菌和促进植物生长有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1葡萄根癌病的研究概况

1.1.1葡萄根癌病概况

1.1.2葡萄根癌菌概况

1.1.3葡萄根癌病发生规律

1.1.4葡萄根癌病防治

1.2细菌素与根癌病生防菌的作用机理

1.2.1细菌素

1.2.2根癌病生防菌的作用机理

1.3细菌基因克隆方法

1.3.1反向遗传法克隆基因

1.3.2同源序列克隆基因

1.3.3图位克隆

1.3.4转座子标签法克隆基因

1.4 HX2生防菌株研究进展

1.5本研究的立题依据、研究目的和研究意义

第二章 生防菌HX2产素突变体的获得及突变体部分生物学特性研究

2.1前言

2.2材料和方法

2.2.1菌株与质粒

2.2.2培养基

2.2.3抗生素

2.2.4试剂

2.2.5缓冲液

2.2.6质粒提取试剂

2.2.7 DNA提取试剂

2.2.8 DNA转膜所用试剂

2.2.9 Southern杂交所需要的试剂

2.2.10 HX2对不同抗生素的抗性分析

2.2.11细菌素检测

2.2.12 HX2菌株诱变与不产素突变体的筛选

2.2.13突变体不产生细菌素性状稳定性检测

2.2.14碱裂解法小量提取质粒

2.2.15 CTAB法小量提取细菌基因组DNA

2.2.16总DNA完全酶切

2.2.17毛细管洗脱法将变性DNA转移至尼龙膜上

2.2.18探针DNA片断制备

2.2.19 DNA探针的标记

2.2.20 DNA探针标记效率检测

2.2.21 Southern杂交

2.2.22洗膜

2.2.23免疫检测

2.2.24突变体生理生化性状

2.2.25突变体生长性状

2.2.26突变体在温室对葡萄根癌病生防能力检测

2.3结果与分析

2.3.1生防菌株HX2对不同抗生素的抗性分析

2.3.2生防菌株HX2菌株诱变与不产素突变体的筛选

2.3.3突变体不产生细菌素性状稳定性检测

2.3.4探针DNA制备

2.3.5 Southern杂交检测突变体中Tn5插入拷贝数

2.3.6突变体生理生化性状

2.3.7突变体生长性状

2.3.8突变体在温室对葡萄根癌病生防能力

2.4结论与讨论

第三章 用反向PCR法通过突变体MH16克隆产素相关基因

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1菌株与质粒

3.2.2培养基及试剂

3.2.3酶及生化试剂

3.2.4 Escherichia coli DH5α感受态细胞的小量制备

3.2.5质粒的热击转化

3.2.6生防菌株HX2基因组文库的构建

3.2.7用反向PCR法克隆Tn5插入位点侧翼序列

3.2.8基因组文库筛选

3.2.9三亲杂交互补验证粘粒功能

3.2.10亚克隆

3.2.11测序

3.3结果与分析

3.3.1生防菌株HX2基因组文库的构建

3.3.2突变体MH16中Tn5插入侧翼序列的克隆

3.3.3基因组文库的筛选

3.3.4亚克隆获得产素相关基因全长

3.4结论与讨论

第四章 用鸟枪法通过突变体MH15克隆产素相关基因

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1菌株与质粒

4.2.2培养基及试剂

4.2.3酶及生化试剂

4.2.4 Escherichia coil DH5 α感受态细胞的小量制备

4.2.5质粒的热击转化

4.2.6用鸟枪法克隆Tn5插入位点侧翼序列

4.2.7基因组文库筛选

4.2.8三亲杂交互补验证粘粒功能

4.2.9亚克隆

4.2.10测序

4.3结果与分析

4.3.1突变体MH15中Tn5插入侧翼序列的克隆

4.3.2基因组文库的筛选

4.3.3亚克隆获得产素相关基因

4.3.3产素相关基因序列测定

4.4结论与讨论

第五章 GDH与HX2生防功能的关系

5.1前言

5.2材料和方法

5.2.1菌株、质粒及引物

5.2.2培养基及试剂

5.2.3酶及生化试剂

5.2.4 Escherichia coli DH5α感受态细胞的小量制备

5.2.5质粒的热击转化

5.2.6电击转化感受态细胞制备与电击转化

5.2.7三亲杂交

5.2.8 gdh基因的缺失突变

5.2.9 gdh基因的互补

5.2.10生防菌株HX2及其衍生菌株对K308平板抑制检测

5.2.11生防菌株HX2及其衍生菌株生长性状检测

5.2.12生防菌株HX2及其衍生菌株在温室对葡萄根癌病生防能力检测

5.2.12生防菌株HX2及其衍生菌株在大田对葡萄根癌病生防能力检测

5.3结果与分析

5.3.1 gdh基因缺失突变

5.3.2 gdh基因的互补

5.3.3生防菌株HX2及其衍生菌株对K308平板抑制

5.3.4生防菌株HX2及其衍生菌株生长性状

5.3.5生防菌株HX2及其衍生菌株在温室对葡萄根癌病生防能力

5.3.6生防菌株HX2及其衍生菌株在大田对葡萄根癌病生防能力

5.4结论与讨论

第六章 PQQ与HX2生防功能的关系

6.1前言

6.2材料和方法

6.2.1菌株与质粒

6.2.2酶及生化试剂

6.2.3培养基及试剂

6.2.4 Escherichia coli DH5α感受态细胞的小量制备

6.2.5质粒的热击转化

6.2.6三亲杂交

6.2.7 pqq基因互补实验

6.2.8 MH15产素性状功能互补分析

6.2.9 HX2及其衍生菌株在PDCA平板上产素情况检测

6.2.10生防菌株HX2及其衍生菌株生长性状检测

6.2.11生防菌株HX2及其衍生菌株在温室对葡萄根癌病生防能力检测

6.2.12生防菌株HX2及其衍生菌株在大田对葡萄根癌病生防能力检测

6.3结果与分析

6.3.1 pqq基因互补实验

6.3.2突变体MH15功能互补分析

6.3.3生防菌株HX2及其衍生菌株在PGCA和1/2PGCA平板上产素情况

6.3.4生防菌株HX2及其衍生菌株生长性状

6.3.5生防菌株HX2及其衍生菌株在温室对葡萄根癌病防治

6.3.6生防菌株HX2及其衍生菌株在大田对葡萄根癌病防治

6.4结论与讨论

第七章 生防菌株P94分离与筛选及生防相关性状测定

7.1前言

7.2实验材料和方法

7.2.1实验用菌株

7.2.2实验用培养基和试剂

7.2.3实验方法

7.3结果与分析

7.3.1生防细菌的分离与筛选

7.3.2生防细菌的初步鉴定

7.3.3生防菌株P94抑菌谱

7.3.4生防菌株P94菌株鉴定

7.3.5生防菌株P94致病性检测

7.3.6生防菌株P94对番茄灰霉病的防效

7.3.7生防菌株P94生防相关性状测定

7.4结论与讨论

7.4.1生防细菌的分离筛选

7.4.2生防菌株P94的抑菌谱

7.4.3生防菌株P94鉴定

7.4.4生防菌株P94致病性及对番茄灰霉病的防效

7.4.5生防菌株P94生防相关性状

第八章 总结

附1：Pseudomonas corrugata P94 16S rDNA序列表

参考文献

致谢

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