水生拉恩氏菌HX2菌株防治葡萄根癌病的初步研究

摘要

葡萄根癌病是由葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)引起的一种在生产上造成了较大经济损失的世界性病害。HX2菌株是很有应用前景的生防菌株。本研究系统分析和研究了HX2菌株防治根癌病的相关性状及其作用机理。
　　 HX2菌株对根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、发根土壤杆菌(A.rhizogenes)、葡萄土壤杆菌(A.vitis)三个种的21个菌株；水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、棉花细菌性角斑病菌(Xanthomonas campestris pv.malvacearum)、甘蓝黑腐病菌(Xanthomonas campestripv.campestri)、黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)、番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganense subsp.michiganensis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等植物病原细菌的代表菌株；黄瓜枯萎病菌(Fusarium orysporum f.sp.cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium orysporum f.sp.niveum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和番茄早疫病菌(Alternaria solani)等植物病原真菌及金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)均具有平板抑制效果。表明HX2菌株具有较为广泛的抑菌谱。在温室中以向日葵为指示植物，HX2菌株对由土壤杆菌属三个种的21个菌株引起的根癌病均有不同程度的防治效果。在温室葡徇活体植株上，HX2菌株菌体和上清液对由A.vitis K308引起的冠瘿瘤的形成均有不同程度的抑制作用，但发酵液上清液的防效优于菌体的防效。大田试验中，HX2菌株对由A.vitis K308引起的葡萄根癌病有良好的防治效果，应用HX2菌株处理的葡萄植株根癌病的发病率及病情指数均有显著性降低，防效达到80.2％。
　　 通过部分生理生化特性和BIOLOG代谢指纹及16S rDNA序列测定和分析，鉴定HX2菌株为水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)。应用质粒pSMC21转化HX2菌株感受态细胞，获得了绿色荧光蛋白基因gfp标记的HX2菌株。该标记菌株能稳定表达绿色荧光，在生长速度、产生抗菌物质和生防效果等方面与野生型菌株均无显著性差异。GFP标记示踪表明HX2菌株在葡萄根表面和根际土壤中存活定殖时间均可以达到三个月；对土壤微生物群体数量无显著影响；在自然水体中存活能力差。
　　 HX2菌株产生抗菌物质的最适培养基筛选试验表明，在碳源为葡萄糖、氮源为有机氮的培养基中能产生大量的抗菌物质。HX2菌株抗菌物质产生的适合培养条件为：28℃，初始pH为8.0，装瓶量为30％，震荡培养16 h。从HX2菌株发酵液中分离提取并部分纯化了抗菌物质，物理和化学性质表明它可能是一种含有糖类基团的非蛋白和非酚类的极性小分子物质。该抗菌物质粗提物具有良好的热稳定性，对部分蛋白酶及RNase不敏感，对碱敏感，在pH为6.0-12.0处理30分钟则完全丧失活性。该物质在200-320 nm范围内均有强烈的吸收，最大吸收波长为285 nm。
　　 HX2菌株不产生嗜铁素、HCN、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等活性物质，不产生也不降解AHLs信号物质；产生IAA和磷酸酯酶。产生抗菌物质是HX2菌株防治葡萄根癌病的重要因素。抗菌物质粗提物对病菌形态及细胞膜渗透性无显著影响，其抑菌作用是通过干扰菌体RNA和蛋白质的合成实现的。

目录

文摘

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论文说明：缩略词

声明

第一章 绪论

1.1葡萄根癌病的研究概况

1.1.1葡萄根癌病的危害

1.1.2根癌菌的致病机制

1.1.3葡萄根癌病的防治

1.1.4根癌病生防菌的作用机制

1.2肠杆菌属菌株防治植物病害研究进展

1.2.1植物病害生防菌株

1.2.2生防机理

1.3拉恩氏菌属菌株研究进展

1.4本研究的立题依据、研究目的和研究意义

第二章 HX2菌株生防效果检测

引言

2.2材料与方法

2.1.1供试菌株

2.1.2培养基

2.1.3仪器与设备

2.1.4植物材料

2.1.5 HX2菌株防治根癌病效果检测

2.1.6 HX2菌株平板抑制植物病原细菌效果检测

2.1.7 HX2菌株平板抑制植物病原真菌效果检测

2.1.8数据分析与统计

2.2结果与分析

2.2.1 HX2菌株防治根癌病效果

2.2.2 HX2菌株平板抑制植物病原细菌效果

2.2.3 HX2菌株平板抑制植物病原真菌效果

2.3讨论

第三章 HX2菌株生物学特性的研究

引言

3.1材料与方法

3.1.1供试菌株及质粒

3.1.2培养基

3.1.3试剂与仪器

3.1.4植物材料

3.1.5 DNA操作与序列分析

3.1.6 HX2菌株生理生化测定及BIOLOG系统鉴定

3.1.7 HX2菌株透射电镜观察

3.1.8 HX2菌株16S rDNA克隆

3.1.9 HX2菌株的gfp标记

3.1.10标记菌株gfp的稳定性检测

3.1.11 gfp标记菌株与野生型HX2菌株的生长情况比较

3.1.12 gfp标记菌株与野生型HX2菌株防治葡萄根癌病效果检测

3.1.13 HX2菌株在水中存活能力的检测

3.1.14 HX2菌株对土壤微生物的影响

3.1.15 HX2菌株致病性检测

3.1.16数据统计与分析

3.2结果与分析

3.2.1 HX2菌株的鉴定

3.2.2 HX2菌株的gfp标记

3.2.3 gfp标记菌株的稳定性

3.2.4 gfp标记菌株与野生型HX2菌株生长情况比较

3.2.5 gfp标记菌株与野生型HX2菌株防治葡萄根癌病效果检测

3.2.6 HX2菌株在水中存活能力的检测

3.2.7 HX2菌株对土壤微生物的影响

3.2.8 HX2菌株致病性检测

3.3讨论

第四章 HX2菌株抗菌物质产生的条件

引言

4.1材料与方法

4.1.1供试菌株

4.1.2培养基

4.1.3试剂与仪器

4.1.4 HX2菌株抗菌物质活性检测

4.1.5 HX2菌株产生抗菌物质的培养条件

4.1.6 HX2菌株代谢液的基本特性分析

4.1.7数据统计与分析

4.2结果与分析

4.2.1 HX2菌株产生抗菌物质的最适培养基筛选

4.2.2碳、氮源对HX2菌株产生抗菌物质的影响

4.2.3温度对HX2菌株产生抗菌物质的影响

4.2.4 HX2菌株培养条件的确定

4.2.5 HX2菌株代谢液的基本特性

4.3讨论

第五章 HX2菌株抗菌物质提取与初步纯化

引言

5.1材料与方法

5.1.1供试菌株

5.1.2培养基

5.1.3试剂与仪器

5.1.4HX2抗菌物质的分离提取

5.1.5薄层层析分析

5.1.6 HPLC分析

5.1.7 HX2菌株抗菌物质生物活性的测定

5.1.8 HX2菌株抗菌物质粗提物性质分析

5.1.9数据统计与分析

5.2结果与分析

5.2.1 HX2菌株抗菌物质分离与提取

5.2.2 HX2菌株抗菌物质薄层层析

5.2.3 HX2菌株抗菌物质HPLC分析

5.2.4 HX2菌株抗菌物质生物活性检测

5.2.5 HX2菌株抗菌物质粗提物性质分析

5.3讨论

第六章 HX2菌株防治葡萄根癌病机理的初步研究

引言

6.1材料与方法

6.1.1供试菌株

6.1.2培养基

6.1.3试剂和仪器

6.1.4植物材料

6.1.5抗菌物质粗提物生防效果检测

6.1.6 HX2菌株抗菌物质抑菌机理的初步研究

6.1.7 HX2菌株定殖能力的检测

6.1.8 HX2菌株产生生防相关活性物质的检测

6.1.9 HX2菌株产生IAA的检测

6.1.10 HX2菌株产生AHLs信号分子的检测

6.1.11 HX2菌株降解AHLs信号分子的检测

6.1.12数据统计与分析

6.2结果与分析

6.2.1抗菌物质粗提物生防效果检测

6.2.2 HX2菌株抗菌物质抑菌机理的初步研究

6.2.3 HX2菌株定殖能力的检测

6.2.4 HX2菌株产生生防相关活性物质的检测

6.2.5 HX2菌株产生IAA检测

6.2.6产生或降解AHLs信号分子能力检测

6.3讨论

第七章 结论与讨论

7.1结论

7.2讨论

7.3进一步设想

参考文献

附录

致谢

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