水生拉恩氏菌HX2及其应用

摘要

本发明提供了一种水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株HX2(菌种保藏号：CGMCC No.1896)，分离于北京葡萄园，可以产生拮抗物质及生长素(IAA)。对部分植物病原细菌(Agrobacterium、Xanthomonas、Clavibacter、Pseudomonas、Bacillus)、部分植物病原真菌(Fusarium、Alternaria、Botrytis)有平板抑制作用。以温室向日葵苗为指示植物检测了HX2对21株土壤杆菌引起的根癌病的防治效果，结果表明，HX2对供试的菌株引起的根癌病均有一定的防效，防效为39.8％至100％，其能够有效地降低植物根癌病的发病率，为葡萄的丰产创造了条件。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体地说是水生拉恩氏菌HX2及其在生物防治中的应用。

背景技术

葡萄根癌病在世界上普遍发生。葡萄根癌病的典型症状是形成肿瘤。发病部位主要在主干靠近地面的部位(根颈部)，也可在土表稍下处或离地面较近的葡萄架面上发生。葡萄根癌病在我国的东北、华北、西北、黄河及长江流域的许多省市区的果园和苗圃均有不同程度的发生，其中辽宁、吉林、内蒙古、北京、河北、山西、山东、浙江和上海等地病害发生严重。一些葡萄园发病率高达80-90％，产量损失达30-70％，严重时甚至毁园绝收，造成重大经济损失。由于根癌病的发生与病原菌的Ti质粒有关，当土壤杆菌侵入植物受伤组织后，其Ti质粒上的T-DNA可以进入植物细胞并整合到植物DNA上，T-DNA在植物体内的表达引起根癌的形成，因此应用一般的化学药剂不能取得良好的防治效果。二十世纪七十年代澳大利亚的Kerr发现K84菌株，使得根癌病的防治出现重大突破，此后，应用生防菌株对根癌病进行生物防治取得了显著成效。但是，K84只对含胭脂碱型或农杆菌素A型Ti质粒的A.tumefaciens和A.rhizogenes根癌菌有效，对A.vitis引起的葡萄根癌病没有效防。因此，寻找多种来源的生防菌株成为防治葡萄根癌病的主要手段。目前，已有多株无致病性的Agrobacterium、Pseudomonas和Bacillus防治葡萄根癌病的报道。Bell报道Rahnella aquatili JC577菌株对葡萄土壤杆菌有平板抑制作用，然而其不能防治葡萄根癌病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水生拉恩氏菌新菌株HX2及其在生物防治中的应用。

本发明菌株HX2是从北京远郊葡萄园土壤中分离得到的水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株，已于2006年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号CGMCC No.1896。

HX2具体通过如下方法分离得到：从北京远郊葡萄园中采集土样，取10g加入内装90mL无菌生理盐水的三角瓶中，28℃，150rpm摇床震荡15min，静置10min后，取0.5mL加入4.5mL无菌生理盐水中，再依次稀释10^-2，10^-3，10^-4倍，分别取以上土壤悬浮液100μL在NA培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH7.0-7.2)平板上均匀涂板，超静工作台内吹干，每个浓度重复3次，28℃温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，以葡萄土壤杆菌(A.vitis)K308为靶标菌，利用双层培养法进行拮抗菌的初步筛选；对获得的拮抗菌摇瓶发酵后检测温室防病效果，最终筛选出性状优良的生防菌株水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)HX2。

HX2具有如下特性：

革兰氏染色阴性，电子显微镜观察，菌体短杆状，直径为0.8μm，周生多鞭毛(见图1)。可在含有2％NaCl的培养基上生长，可在4℃～41℃培养条件下生长，接触酶、柠檬酸盐利用、VP、精氨酸双水解酶、丙二酸盐利用、苯丙氨酸利用等反应为阳性，发酵葡萄糖产酸产气，发酵阿拉伯糖、山梨醇、蔗糖产酸，氧化酶、甲基红、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、明胶液化、水解纤维素、淀粉酶、H₂S、酒石酸利用、醋酸盐利用等反应阴性。

本发明HX2的16S rDNA序列与目前发表的拉恩氏菌(CDC2987-79)16S rDNA(GENBANK登录号：U88436.1)相似度最高，达99％。综合形态特征与16S rDNA序列鉴定HX2为水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株。

研究表明HX2对多种植物病原菌具有良好的抑菌作用，对葡萄根癌病具有良好的防治作用。

本发明还提供了HX2的发酵培养方法，包括步骤：

1、菌种活化

使用改良523培养基，培养基配方为：蔗糖5-10g/L，KH₂PO₄ 1.0-2.0g/L，酵母膏5-10g/L，CaCO₃ 4.0-6g/L，NaCl 0.1-0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g/L，琼脂15-18g/L，余量为水，pH7.0-7.2。将水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2接种于改良523培养基斜面上，25-28℃培养20-24小时。

2、种子液的培养

种子培养基组成：蔗糖4-6g/L，玉米浆1-3g/L，KH₂PO₄0.03-0.0.07g/L，K₂HPO₄ 0.03-0.07g/L，MgSO₄·7H₂O 0.025-0.05g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.3-0.8g/L，CaCO₃ 1-3g/L，余量为水，pH7.0-7.2。将活化好的HX2用无菌生理盐水配制成10⁸-10⁹CFU/mL的菌悬液，以1-2％的接种量接种于种子培养基中，25-28℃摇床震荡培养，转速为130-180rpm，培养时间为12-16小时。

3、发酵罐发酵

发酵培养基组成为：葡萄糖10-15g/L，酵母膏2-4g/L，NaCl0.5-0.8g/L，KH₂PO₄ 0.25-0.5g/L，K₂HPO₄ 0.25-0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1g/L，(NH₄)₂SO₄ 5-10g/L，菜籽油0.4-0.6g/L，余量为水，pH7.0-7.2。把培养好的种子液以2-4％的接种量接入发酵罐中，20-28℃，搅拌速度为150-180rpm，通气量为1∶0.6-0.8(发酵液体积:每分钟通气量体积)、罐压0.05-0.06MPa。发酵20-24小时，菌量达到5-10×10⁸CFU/mL得到HX2菌液。

由于HX2在含有葡萄糖和酵母膏的培养基中可大量产生抗菌物质，具有抑菌活性，因此发酵培养基选用葡萄糖和酵母膏为碳氮源。

本发明还提供了含有HX2的菌剂，其可以通过上述发酵液与草炭土混合制得。

本发明菌株用于生物防治，能够有效地降低植物根癌病的发病率，为葡萄的丰产创造了条件。

附图说明

图1是本发明HX2菌株透射电镜下形态观察(×10000)。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 HX2菌株16S rDNA分析

以水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2基因组DNA为模板，用16S扩增通用引物63F 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’和1494R 5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’。以如下PCR扩增反应体系中扩增：50μL扩增体系，10pmol引物，0.2mM dNTP，1.5mMMgCl₂，2.5 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，1×PCR buffer(TaKaRa)，25ng基因组DNA作模板。PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性40sec，55℃复性40sec，72℃延伸1min，循环数为35；72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后用Omega“Gelextraction kit”回收纯化，连接pMD18-T Vector，转化E.coli DH5α，在Invitrogen公司用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。用BLAST程序在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)相应序列比对的结果表明HX2的16SrDNA序列与目前发表的拉恩氏菌相似性最高，达到99％。

实施例2抑菌谱分析

对植物病原细菌平板抑制检测方法。用双层培养法检测HX2对植物病原细菌的抑制情况。将活化的水生拉恩氏菌HX2配制成菌悬液(10⁹CFU/mL)，吸取10μL点于PDA培养基上，每皿一点，28℃培养48小时，用3mL三氯甲烷以其蒸汽杀死生长的HX2。10-12小时后，将培养好的土壤杆菌菌株及水稻白叶枯病原菌、棉花细菌性角斑病病原菌、甘蓝黑腐病病原菌、黄瓜细菌性角斑病病原菌、番茄溃疡病病原菌、枯草芽孢杆菌斜面分别制成菌悬液，用麦克比浊法确定终菌悬液浓度约为10⁹CFU/mL。分别吸取50μL菌悬液加入5mL融化后冷却到50℃的软YEB培养基(蔗糖5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏1g/L，琼脂7g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH7.0-7.2)中，迅速混匀，立即倒入三氯甲烷杀死的HX2的培养基上，铺成均匀的薄层，28℃培养24小时，观察抑菌圈的出现。

对植物病原真菌的平板抑制检测方法。HX2用改良523斜面28℃下活化48小时，用无菌0.85％生理盐水制成菌悬液，用麦克比浊法确定终菌悬液浓度约为10⁹CFU/mL。真菌点种在PDA平板上25℃活化72小时，使其长成大菌落，用0.4cm的打孔器打取带菌培养柱(菌饼)，在每个PDA平板的中间放一片菌饼。把用同孔径打孔器打好并灭菌的双层滤纸放在PDA平板上，每皿放四片，每片距离平板的中心为3cm，相邻的两片滤纸为90°。在滤纸上加20μL HX2菌悬液，以加生理盐水为对照，每个处理4个重复，25℃下培样4天、5天、6天、7天后分别测量真菌的菌落直径，并计算抑制生长率。抑制生长率按照如下公式计算：

抑制生长率＝(C-T)/C×100％

C：对照真菌生长直径

T：接种HX2后真菌生长直径

HX2对土壤杆菌平板抑制结果如表1所示。

表1 HX2对土壤杆菌平板抑制(单位：mm)

 菌株 A.tumefaciens  抑菌圈直径  Inhibition  zone(dia.)菌株A.rhizogenes  抑菌圈直径  Inhibition  zone(dia.)  菌株  A.vitis  抑菌圈直径  Inhibition  zone(dia.) C58  28.8±3.5^aK27  26.4±1.9  K308  33.8±3.3 AC11  29.7±3.6K75  39.1±3.4  G11(3)  39.1±3.6 B6S3  35.9±2.1NL12-2  41.3±2.5  G7(2)  25.8±3.1 MG14-2  27.7±2.1B1  40.8±2.7  MI23-1  31.5±2.1 MG10-1  42.9±5.2D2  30.8±3.7  MB26-1  27.3±1.5 CY4  30.0±3.8 CY31  24.3±1.9 CY32  28.5±2.6 Pt12  30.5±3.7 Y5-1  39.8±2.1 MI4-6  38.0±2.8

注：a表示标准差

HX2对其它植物病原细菌平板抑制结果如表2所示。

表2 HX2对植物病原细菌平板抑制(单位：mm)

植物病原细菌    抑菌圈直径(mm)  植物病原细菌  抑菌圈直径(mm)甘蓝黑腐病原菌    18.3±0^a  水稻白叶枯病原  菌  27.6±1.7黄瓜角斑病原菌    22.5±1.0  棉角斑病原菌  28.9±1.9番茄溃疡病原菌    39.0±2.1

注：a表示标准差

HX2对植物病原真菌平板抑制结果如表3所示。

表3 HX2对植物病原真菌平板抑制

天数植病真菌菌落对照 直径^a 处理  抑制生长率  ％植病真菌菌落对照 直径 处理  抑制生长率  ％4番茄早疫45.2 35.0  22.8黄瓜枯萎51.7 41.9  19.1番茄灰霉51.3 40.7  20.8西瓜枯萎52.7 41.4  21.65番茄早疫57.7 39.5  31.8黄瓜枯萎65.2 47.3  27.6番茄灰霉62.2 48.6  22.0西瓜枯萎66.0 49.0  25.96番茄早疫70.8 53.1  39.3黄瓜枯萎80.7 57.0  29.5番茄灰霉77.7 60.3  21.9西瓜枯萎83.3 61.8  29.97番茄早疫77.2 46.5  40.0黄瓜枯萎82.3 60.5  26.6

    番茄灰霉80.3 62.4    22.4西瓜枯萎84.0 67.3    20.0

注：a表示直径，单位：mm

实施例3温室防治根癌病效果检测

HX2接种于PDA液体培养基中28℃，150rpm摇培28小时。供试的土壤杆菌配制成浓度为10⁸CFU/mL的菌悬液，分别与2倍体积的HX2菌液及无菌生理盐水混合，同时以HX2菌液和无菌生理盐水接种作对照。用灭菌接种针在向日葵茎段上呈纵向划伤，造成长为0.5cm的伤口，吸取3μL待测液接种于伤口中，以parafilm封口膜包裹伤口，温室内培养15天后观察结瘤情况并称瘤重。每种处理设30个重复，该实验重复三次。

防效(％)＝(对照根癌瘤平均重-处理根癌瘤平均重)÷(对照根癌瘤平均重)×100％

HX2温室防治根癌病效果结果如表4

表4 HX2温室防治根癌病效果

 菌株 A. tumefaciens  防效(％)  菌株  A.  rhizogenes  防效(％)  菌株  A.vitis  防效(％) C58  82.6  K27  98.8  K308  95.9 AC11  80.6  K75  98.8  G11(3)  81.6 B6S3  39.8  NL12-2  88.9  G7(2)  84.0 MG14-2  96.1  B1  96.1  MI23-1  66.9 MG10-1  66.7  D2  100  MB26-1  97.4 CY4  100 CY31  100 CY32  80.1 Pt12  91.5 Y5-1  84.2 M14-6  100

实施例4温室防治葡萄根癌病效果检测

将HX2接种于PDA液体培养基中，28℃，150mm摇培28小时。供试的葡萄土壤杆菌(A.vitis)K308配制成浓度为10⁸CFU/mL的菌悬液，分别与2倍体积的HX2菌液及无菌生理盐水混合。每个处理使用4株葡萄茎段，每株茎段从第3片叶至第7叶间接种4个接种点，以灭菌接种针在茎段上造成长0.8cm的伤口，吸取10μL待测液接种于伤口中，以parafilm封口膜包裹伤口，30天后观察结瘤情况并称瘤重。本试验重复三次，防效计算同上。HX2对由葡萄土壤杆菌(A.vitis)K308引起的根癌病的防效达到99.5％。

实施例5大田防治葡萄根癌病效果检测

试验小区采用随机区组排列，每种处理重复4次，小区完全随机排列，每小区60个植株。保护带设置为3米。

选用一年生2-3个节的葡萄剪切的扦插条用无菌水洗净根部；致病菌葡萄土壤杆菌(A.vitis)K308接种于改良523液体培养基中28℃摇床培养48小时至菌量为10⁸CFU/mL，生防菌HX2菌剂与病菌K308两者以1∶1(千克∶升)混合后，将上述葡萄扦插条根部浸入菌液，10分钟后取出栽种，以单独接种葡萄土壤杆菌(A.vitis)K308与草炭土的混合液为对照。接种后植株按照生产上的实际情况进行常规的水肥管理。生长约7个月(4月中旬～11月中旬)后，挖出，检查肿瘤的形成并称量瘤重。统计发病率和防效。

发病率(％)＝(长瘤的植株数量+死亡的植株数量)÷栽种的植株总数×100％

防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)÷对照发病率×100％

单独接种葡土壤杆菌(A.vitis)K308的葡萄根癌病的发病率为93.75％，发病植株肿瘤较大。接种HX2菌剂的葡萄根癌病的发病率为17.5％，发病植株的肿瘤较小，防效为81.3％。因此，HX2菌剂对葡萄根癌病有良好的防效。

实施例6生防相关性状检测

吲哚乙酸(IAA)检测。IAA为植物激素，可以促进植物生长，从而提高植物抗病性。HX2接种于NA培养基(蛋白胨5g/L，酵母抽提物1.5g/L，牛肉膏1.5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0-7.2)和添加0.5g/L色氨酸NA培养基中，28℃摇培12小时后取样。取样5mL，12000rpm离心10min，取2mL上清，加入100μL的10mM磷酸，4mL检测液(1mL的0.5M FeCl₃溶于50mL of 35％HClO₄)，室温反应25min后用分光光度计测530nm处光吸收。用纯品IAA配制溶液测量标准吸收曲线，并计算HX2产生IAA的量。HX2培养12个小时后在含有色氨酸的NA培养基中产生IAA的浓度达到24.8μg/mL。在不含有色氨酸的NA培养基中产生IAA的浓度为4.1μg/mL。  磷酸酯酶活性测定。磷酸酯酶具有分解磷的作用，因此产生磷酸酯酶的生防菌施用后可以分解土壤中的无机磷，从而提高土壤中植物可利用磷的含量，起到促进植物生长，提高植物抗病性的作用。用Pikovskaya’s平板检测磷酸酯酶活性。Pikovskaya’s平板配制方法为：酵母抽提物0.5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙5g/L，硫酸铵0.5g/L，氯化钾0.2g/L，氯化镁0.1g/L，硫酸锰0.0001g/L，硫酸亚铁0.0001g/L，琼脂15g/L把HX2接种于Pikovskaya’s平板中央，28℃培养7天后检测。在菌落周围出现透明圈，表明HX2具有磷酸酯酶活性。

实施例7发酵法制备HX2

1、菌种活化

使用改良523培养基，培养基配方为：蔗糖10g/L，KH₂PO₄2.0g/L，酵母膏10g/L，CaCO₃5.0gg/，NaCl 0.2g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3g/L，琼脂15g/L，pH.0-7.2。将HX2接种于改良523培养基斜面上，28℃培养24小时。

2、种子液的培养

种子培养基的组成：蔗糖5g/L，玉米浆2g/L，KH₂PO₄0.05g/L，K₂HPO₄ 0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.025g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，CaCO₃2g/L，pH 7.0-7.2。将活化好的HX2用无菌生理盐水配制成10⁸CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于种子培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为16小时。

3、发酵罐发酵

发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，NaCl 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.25g/L，K₂HPO₄ 0.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，pH7.0-7.2。把培养好的种子液以2％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1∶0.6-0.8(发酵液体积:每分钟通气量体积)、罐压0.05MPa。发酵20小时，菌量达到5-10×10⁸CFU/mL得到HX2菌液。

实施例8  菌剂制作

将实施例7发酵好的HX2菌液每升与4千克草炭土搅拌混合均匀，得到HX2菌剂。产品含水量为30-40％，每克菌剂含有1-2×10⁸CFU的水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2。

<110>中国农业大学

<120>水生拉恩氏菌HX2及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1491

<212>DNA

<213>Rahnella aquatilis HX2

<400>1

tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga gattcaggcc taacacatgc     60

aagtcgagcg gcagcggaaa gtagcttgct actttgccgg cgagcggcgg acgggtgagt    120

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