芪蛭皱肺颗粒对LPS诱导致炎肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖和生物学活性的影响

摘要

目的：探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)的原代培养方法。通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造细胞炎症模型,芪蛭皱肺颗粒给药干预,观察其对致炎 AT-Ⅱ细胞形态学、生长周期、线粒体活性、肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的影响。以探察其防治慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的作用机制,同时为开发研究芪蛭皱肺颗粒提供药效学基础。
　　方法：取SPF级新生Wistar大鼠肺脏,采用胰蛋白酶联合胶原酶消化法分离 AT-Ⅱ细胞,免疫黏附结合反复贴壁法纯化细胞,体外培养细胞,透射电镜鉴定细胞。细胞造模方法:10组生长状态及数目接近的细胞,2组不加 LPS,2组加5ug/ml的 LPS,2组加10ug/ml的 LPS,2组加20ug/ml的 LPS,2组加40ug/ml的 LPS,干预1天。第二天,向用5种浓度 LPS干预过的细胞其中一组加入100ug/ml的芪蛭皱肺颗粒,干预2天,同浓度的另一组作对照。观察并检测各组AT-Ⅱ细胞的形态学改变,板层小体、线粒体和生长周期的变化,以及 SP-A的表达。
　　结果：(1)原代培养的 AT-Ⅱ细胞生长状态良好。(2)电镜下观察到板层小体。LPS组板层小体数目减少,芪蛭皱肺颗粒干预组其数目有所增加。(3) MTT显示,LPS组 AT-Ⅱ细胞出现异常增殖情况,且其增殖率随 LPS浓度的升高而加强。芪蛭皱肺颗粒干预后,细胞增殖受到了抑制,增殖率有所下降。(4)细胞周期检测结果显示,LPS组 AT-Ⅱ细胞的细胞周期处于 G2期和 S期的百分比较高。其增殖百分比随着 LPS浓度的升高而上升。芪蛭皱肺颗粒干预后,G2期和 S期的百分比有所下降。(5)激光共聚焦显微镜观察线粒体罗丹明123染色结果显示,空白组细胞的线粒体活性强,荧光亮度高。LPS组随着其浓度的升高,荧光强度逐渐减弱。加入芪蛭皱肺颗粒干预后,荧光强度有所恢复。(6)SABC免疫组化法检测 SP-A显示:①DAB显色:空白组的 AT-Ⅱ细胞质内可以观察到较多的棕黄色颗粒。空白加芪蛭皱肺颗粒组细胞内可见较空白组更多的棕黄色颗粒,颜色较深。而 LPS组细胞内棕黄色颗粒明显减少,且 LPS浓度越高,其棕黄色颗粒越少、颜色越浅。芪蛭皱肺颗粒干预组的细胞内,棕色颗粒较之同浓度LPS诱导组有所增加,且颜色有一定加深。②FITC荧光染色:空白组的 AT-Ⅱ细胞荧光较强。空白加芪蛭皱肺颗粒组细胞荧光强度较空白组更大。而LPS组细胞荧光强度减弱,且随着 LPS浓度的增高,荧光越来越淡,芪蛭皱肺颗粒干预组细胞的荧光强度较之同浓度 LPS诱导组有所增加。
　　结论：本次实验提取的原代 AT-Ⅱ细胞符合体外实验要求,第24~72 h内处于最佳生长状态,是进行实验研究的理想时间段。LPS可以促使 AT-Ⅱ细胞产生炎症反应而异常增殖,并减弱 AT-Ⅱ细胞的 SP-A表达,降低该细胞的生物学活性。芪蛭皱肺颗粒对 LPS诱导致炎肺泡Ⅱ型上皮细胞的异常增殖有抑制作用,可改善细胞超微结构,促进 SP-A表达,有助于提高 AT-Ⅱ细胞的生物学活性。

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缩 略 词 表

前 言

一 立 题 依 据

1 国内外医学对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的认识

2 芪蛭皱肺颗粒与 COPD 的关系

3 肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）与 COPD 的关系

二 实 验 研 究

1 实验技术路线图

2 材料与方法

3 实验结果与分析

三 讨 论

1 肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）的原代培养

2 肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）的鉴定和生长状况

3 AT-Ⅱ细胞的特征性结构板层小体（Lb）

4 AT-Ⅱ细胞活力检测

5 细胞周期检测

6 线粒体检测

7 免疫组化检测

8 芪蛭皱肺颗粒的作用机制与效应

四结 语

1 结论

2 问题与展望

参考文献

致谢

附 录