PCR方法鉴别早期胚胎性别及相关技术的研究

摘要

本论文研究了小鼠和牛早期胚胎的徒手切割取样方法、切割取样胚胎冷冻—解冻方法和PCR方法鉴别牛早期胚胎性别技术，并应用牛Y-染色体特异引物PCR扩增牛、牦牛、山羊、绵羊、小鼠、猪等6个动物基因组，克隆测定扩增产物的序列。试验结果表明： 1.体视显微镜下，应用玻璃切割针徒手切割取样小鼠和牛胚胎，切割取样后胚胎体外培养48小时的发育率分别为76.7﹪(46/60)和80﹪(16/20)，牛新鲜胚胎和冷冻—解冻胚胎切割取样后移植妊娠率分别为47.1﹪(8/19)和42.9﹪(6/17)。 2.分别以10﹪甘油、10﹪乙二醇作为冷冻液以及在以上两种冷冻液中分别添加10﹪葡聚糖+0.1M蔗糖作为冷冻液常规冷冻方法冷冻切割后的小鼠胚胎，冷冻—解冻后体外培养72小时总发育率分别为56.9﹪(259/455)，81.8﹪(317/)，84.8﹪(540/738)和59.5﹪(308/518)。取样后胚胎体外短暂培养(0-4小时)并不能提高切割取样后小鼠胚胎冷冻—解冻体外培养发育率。 3.切割取样小鼠胚胎快速冷冻体外培养发育率为73.3﹪(33/45)，切割取样牛胚胎在25﹪甘油+0.25M蔗糖+20﹪血清的PBS为冷冻液快速冷冻后移植妊娠率为57.1﹪(4/7)。 4.依据牛Y染色体特异序列设计合成5对Y染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异内标引物。应用合成的引物单重PCR扩增牛血样DNA，筛选到4对牛Y染色体特异引物和一对牛DNA特异内标引物。应用所筛选的4对牛Y-染色体特异引物和内标引物分别PCR扩增牛基因组DNA、成纤维细胞和胚胎，筛选出2个可用于牛胚胎性别鉴别的多重PCR引物组合：B34/A12、B78/A12。建立了两温度循环PCR方法(94℃变性15s和55℃退火15s，以94℃变性1s和55℃退火1s)并鉴别牛胚胎性别，将PCR扩增时间减少到50分钟左右。 5.设计合成的5对牛Y-染色体特异引物都可以扩增牛和牦牛Y-染色体，引物B90在绵羊中也有扩增产物，其他动物均未获得扩增产物。扩增产物序列测定结果表明，2对牛Y-染色体特异引物(引物B90、B12)所扩增牦牛的产物序列为已知序列，2对牛Y-染色体特异引物(引物B78、B34)所扩增牦牛的产物序列为新序列。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述：牛胚胎性别鉴别及相关技术的研究进展

第二章胚胎切割技术的研究

第三章PCR胚胎性别鉴别的引物筛选及条件优化的研究

第四章牛Y-染色体特异序列引物PCR扩增不同动物的产物克隆测序及比较分析

第五章结论

参考文献

附录

缩略表

致谢

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