蓝圆鲹组织蛋白酶及激肽原对鱼糜凝胶的作用

摘要

在鱼糜制品生产过程中，凝胶劣化现象是影响鱼糜品质下降的重要原因。目前研究认为，溶酶体中含有的内源性组织蛋白酶，尤其是组织蛋白酶L会促进肌原纤维蛋白的降解，进而导致鱼糜凝胶劣化。因此，添加食物源性的组织蛋白酶抑制剂将可能达到提高鱼糜制品弹性，改善品质的效果。 本研究首先以海水鱼蓝圆鲹为实验材料，通过硫酸铵盐析、离子交换层析、亲和层析和凝胶过滤层析等方法从肌肉中纯化得到组织蛋白酶L和B。组织蛋白酶L和B的回收率分别为1.5％和3％，纯化倍数分别为1638.0倍和2619.3倍。SDS-PAGE电泳结果表明纯化的组织蛋白酶L和B的分子量分别为30kDa和27kDa。肽质量指纹图谱分析表明，纯化的组织蛋白酶L与尖吻鲈（lates calcarifer）的组织蛋白酶L在108个氨基酸的蛋白质区域中有44％的氨基酸序列相同，两者在生物学上表现出很高的同源性。性质分析结果表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对组织蛋白酶L有强烈的抑制效果，而其它类型的蛋白酶抑制剂则没有明显的抑制作用。组织蛋白酶L和B都只对组织蛋白酶类的荧光底物有强烈的分解，两者的区别在于组织蛋白酶L只水解Z-Phe-Arg-MCA，而组织蛋白酶B不仅水解Z-Phe-Arg-MCA还水解Z-Arg-Arg-MCA。在以Z-Phe-Arg-MCA为荧光底物时，蓝圆鲹组织蛋白酶L的Km值为2.77μmol/L，Vmax为0.04μmol/L，kcat值为22.76S-1。 其次，本研究以猪血为原料，通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法从中分离纯化出两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂激肽原（Ⅰ和Ⅱ）。激肽原Ⅰ和Ⅱ的回收率分别为0.7％和24.1％，纯化倍数分别为613.7倍和295.7倍。SDS-PAGE电泳结果表明激肽原Ⅰ和Ⅱ的分子量分别为58 kDa和116 kDa。从性质分析结果可知，激肽原Ⅰ和Ⅱ对木瓜蛋白酶的抑制情况相似，激肽原Ⅰ和Ⅱ的(IC50)分别为3μg/mL和3.5μg/mL。 进一步研究表明，激肽原Ⅰ和Ⅱ对以淡水白鲢鱼为主要原料的鱼浆中肌原纤维蛋白降解都有一定的抑制作用，尤其是肌球蛋白重链，但是对海水鱼蓝圆鲹鱼浆中肌原纤维蛋白降解与鱼的捕获季节有关。当激肽原Ⅱ添加量为鱼浆重量的0.03％时，可使淡水鱼糜凝胶强度提高24％。因此，激肽原可作为添加剂以有效提高淡水鱼糜制品的凝胶强度。

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 引言

1．1 蓝圆鲹

1．2 鱼糜制品

1．3 组织蛋白酶

1．4 半胱氨酸蛋白酶抑制剂

1．5 本研究的目的与内容

第2章 材料与方法

2．1 实验原料

2．2 试剂

2．2．1 层析树脂

2．2．2 荧光底物

2．2．3 蛋白酶抑制剂

2．2．4 SDS-PAGE

2．3 实验所用溶液及其配制

2．3．1 组织蛋白酶分离纯化

2．3．2 组织蛋白酶性质分析

2．3．3 激肽原分离纯化

2．3．4 激肽原性质分析

2．3．5 SDS-PAGE

2．3．6 普通银染色

2．3．7 快速银染色

2．4 实验仪器

2．5 实验方法

2．5．1 蛋白质浓度测定

2．5．2 组织蛋白酶活力测定

2．5．3 激肽原抑制活力测定

2．5．4 SDS-PAGE

2．5．5 组织蛋白酶L的分离纯化

2．5．6 组织蛋白酶L的性质分析

2．5．7 组织蛋白酶B的分离纯化

2．5．8 猪血中激肽原的分离纯化

2．5．9 猪血激肽原的性质分析

2．5．10 组织蛋白酶L与肌原纤维蛋白降解的关系

2．5．11 激肽原对鱼肌原纤维蛋白降解的抑制效果

2．5．12 激肽原对鱼糜凝胶强度的影响

第3章 结果与分析

3．1 蓝圆鲹肌肉组织蛋白酶L的分离纯化

3．1．1 组织蛋白酶L的纯化结果

3．1．2 组织蛋白酶L的性质分析

3．2 蓝圆鲹肌肉组织蛋白酶B的分离纯化

3．2．1 蓝圆鲹肌肉组织蛋白酶B的纯化结果

3．2．2 组织蛋白酶B的底物特异性研究

3．3 猪血中激肽原的分离纯化

3．3．1 激肽原的纯化结果

3．3．2 激肽原对木瓜蛋白酶活力的影响

3．3．3 激肽原对不同蛋白酶活力的影响

3．3．4 激肽原的性质分析

3．4 组织蛋白酶L与肌原纤维蛋白降解的关系

3．5 激肽原对鱼肌原纤维蛋白降解的抑制作用

3．6 激肽原对鱼糜凝胶强度的影响

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 研究的特色与创新

5．3 展望

致谢

参考文献

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