利用罗非鱼鱼皮及刺参体壁制备ACE抑制肽

摘要

胶原肽是指胶原蛋白经蛋白酶降解制备获得，具有一定生理功能的活性多肽。胶原肽由于其较小的分子量易被消化吸收，同时具有降血压、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，因此在生物医药、保健品及美容领域具有广阔的应用前景。
　　本文首先以罗非鱼(Oreochromis sp)鱼皮为原料，通过酸法制备得到高纯度的胶原蛋白(ASC)。利用南美白对虾(Litopenaeus vannamei)虾头肝胰腺中制备的胰蛋白酶，对罗非鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解，通过单因素法对其制备工艺进行优化。优化获得酶解的最佳工艺参数为:加酶量17，000U/g，酶解时间90min，酶解温度40℃，pH8.0。其中酶解产物分子量＜3kDa多肽所占比例为99.7％。利用SP-Sepharose阳离子交换柱层析，Sephadex G-15凝胶过滤柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)，从该酶解产物中纯化获得高纯度的ACE抑制肽。经MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析确定其氨基酸序列为NPARTCR，经测定其ACE抑制活性IC50值为61.4μmol/L。用脯氨酸内肽酶(PSEP)对该七肽进行酶解，制备获得更高ACE抑制活性的五肽ARTCR，其ACE抑制活性IC50值为77.0μmol/L。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法对两种ACE抑制肽的抑制模式进行研究，NPARTCR和ARTCR对ACE酶均表现为非竞争性抑制作用。稳定性结果表明，在高温、酸性和碱性条件下NPARTCR和ARTCR均具有较好的稳定性，其中NPARTCR在模拟肠液消化中，被降解成了分子量更小的多肽，消化产物失去ACE抑制活性，但ARTCR具有较强的抵抗胃肠道蛋白酶消化的能力。同时NPARTCR和ARTCR均不会对Caco-2细胞产生毒性作用。NPARTCR实验组SHR大鼠在灌胃后血压无显著性降低，而ARTCR对SHR大鼠表现出良好的降压效果，降血压效果可以维持12h。
　　刺参(Stichopus japonicus)是名贵的海洋生物，其可食部体壁中胶原纤维含量占其蛋白总量的70％，是制备生物活性肽的良好蛋白原料。本文以刺参体壁为原料，采用复合蛋白酶为工具酶，以Tricine-SDS-PAGE电泳分析和ACE抑制率为考核指标，运用单因素法优化刺参ACE抑制肽的酶解工艺。获得最佳工艺参数为:料液比1∶6，加酶量0.8％(w/w)，反应时间6h，pH7.0。结合膜分离技术制备不同分子量的多肽，其中酶解产物＜3kDa组分具有较高的ACE抑制活性IC50为0.8mg/mL，对ACE表现为非竞争性抑制作用，同时ABTS、DPPH·和·OH自由基清除能力的EC50值分别为2.25mg/mL、3.47mg/mL、7.03mg/mL。刺参肽在高温、酸性和碱性条件下均具有较好的稳定性，并具有较强的抵抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的能力。此外，刺参肽不会对Caco-2细胞产生毒性作用。SHR大鼠灌胃刺参ACE抑制肽，在浓度为300mg/kg时对SHR大鼠表现出良好的降压功效，灌胃后2h，SHR大鼠的血压显著降低，在给药后4h SBP降幅达到最高，为26mmHg。
　　本研究制备的胶原蛋白ACE抑制肽和刺参ACE抑制肽在功能性食品的开发利用方面具有广阔的应用前景。

目录

声明

摘要

主要符号表

1．1 罗非鱼

1．1．1 罗非鱼简介

1．1．2 罗非鱼加工副产物的利用

1．2 胶原蛋白

1．2．1 胶原蛋白简介

1．2．2 胶原蛋白的应用

1．3 刺参

1．3．1 刺参中的生物活性成分及功能

1．4 生物活性肽

1．4．1 抗氧化肽

1．4．2 抗菌肽

1．4．3 降压肽

1．5 研究目的与意义

2．1 材料与试剂

2．1．1 原料

2．1．2 动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 实验所用溶液及配制方法

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 罗非鱼ACE抑制肽的制备

2．2．2 生物活性的测定

2．2．3 罗非鱼ACE抑制肽的分离纯化及氨基酸序列的鉴定

2．2．4 罗非鱼ACE抑制肽的性质研究

2．2．5 刺参ACE抑制肽的制备

2．2．6 Tricine-SDS-PAGE

2．2．7 刺参ACE抑制肽的分离及性质分析

2．2．8 统计分析

第3章 结果与分析

3．1 罗非鱼鱼皮ACE抑制肽的制备及性质分析

3．1．1 罗非鱼鱼皮胶原蛋白的提取

3．1．2 ASC酶解产物的制备

3．1．3 罗非鱼ACE抑制肽的分离纯化

3．1．4 多肽的质谱分析

3．1．5 PSEP对NPARTCR的特异性酶解

3．1．6 NPARTCR和ARTCR的性质研究

3．2 刺参ACE抑制肽的制备及性质分析

3．2．1 蛋白酶的筛选

3．2．2 复合蛋白酶单因素试验

3．2．3 刺参肽的分离及生物活性的测定

3．2．4 刺参ACE抑制肽的性质分析

第4章 讨论

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

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