重组人表皮生长因子PLGA纳米粒经皮治疗大鼠糖尿病溃疡的作用研究

摘要

外伤特别是由烧伤、烫伤等原因引起的大面积皮肤损伤是临床常见创伤，创面常常难以愈合，且常伴随着感染、炎症等问题，创面的愈合速率已成为影响此类外伤临床预后的重要指标。近年来，随着人们生活水平的不断提高，糖尿病的发病率大大提高，患病人数大量增加，在长期糖尿病患者中，糖尿病溃疡是最常见的慢性并发症之一，有约15％的糖尿病患者最终可能患上糖尿病溃疡这种顽固性的皮肤疾病，其病程长，花费大，给患者带来了极大的痛苦，是目前临床上亟待攻克的难题。
　　在外伤愈合或破损皮肤修复的过程中，表皮生长因子发挥着重要的生物学作用。表皮生长因子是单链多肽，分子量约为6kD，等电点为4.6，在皮肤外伤的愈合过程中有着至关重要的作用，可有效促进皮肤的再生和伤口的愈合。通过基因工程重组方法制备的的重组人表皮生长因子(recombinant human EpidermalGrowth Factor，rhEGF)与内源性的表皮生长因子在结构和生物学活性上高度一致，因此目前临床常用基因工程重组的人表皮生长因子经皮给药作为大面积皮肤损伤或溃疡的辅助治疗药物。作为基因工程表达的多肽类药物，目前rhEGF常用的给药剂型为溶液剂或喷雾剂，它们具有生物半衰期短，稳定性差，易被酶解等缺点，在应用方面受到一定的限制。
　　近年来随着纳米技术的迅速发展，经皮给药的纳米制剂也得到了较多的关注，纳米粒因其所具有的独特性能，成为经皮给药的热点研究方向之一。纳米粒可作为药物的储库，起到缓控释给药的作用，还可通过与皮肤脂质的相互作用，增强纳米粒的皮肤透过率，延长药物的作用时间，提高了药物的生物利用度。目前，用于制备纳米粒的载体主要分为天然的大分子体系和可降解的高分子聚合物，高分子聚合物因为纯度高，可选择性强等优点备受关注。其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是唯一被FDA认可的可作为药物辅料的高分子聚合物，其具有良好的生物相容性，可降解性，良好的成膜性和安全性等优点，已被广泛的用于纳米给药系统的制备。
　　本课题拟通过制备得到rhEGF-PLGA纳米给药系统，延长rhEGF的半衰期，提高其稳定性，增强其皮肤透过率和滞留量，并局部缓慢释放药物，同时利用经皮给药靶向性好的特点，达到有效提高皮肤内rhEGF的浓度并延长作用时间的目的。通过观察rhEGF-PLGA纳米粒的透皮效果，体外促进细胞增殖的生物活性，以及在外伤和糖尿病皮肤溃疡动物模型中促进皮肤创面愈合的能力，评价所构建的rhEGF-PLGA纳米粒给药系统的疗效，为rhEGF-PLGA纳米粒新型经皮给药系统的应用奠定研究基础。
　　首先，我们采用W/O/W复乳化溶剂挥发法制备得到了rhEGF-PLGA纳米粒，并通过正交实验的方法对rhEGF-PLGA纳米粒的制备工艺进行优化，以包封率为指标，选择PLGA使用量(A)，泊洛沙姆F-68的浓度(B)，rhEGF的投药量(C)，复乳乳化超声时间(D)作为考察因素，建立L9(3)4正交实验优化rhEGF-PLGA纳米粒的制备工艺。结果表明rhEGF-PLGA纳米粒的最佳制备工艺为:PLGA使用量为200mg，泊洛沙姆F-68的浓度为1％，rhEGF投药量为800μl，复乳化超声时间为1min，各个因素对rhEGF-PLGA纳米粒包封率的影响顺序为A＞C＞D＞B。按最佳制备工艺制备的rhEGF-PLGA纳米粒的平均包封率为(73.99±2.86)％，RSD为3.9％，平均载药量为（1.16±0.02）％，RSD为1.5％，说明该制备工艺具有可靠的稳定性。利用透射电镜、激光粒度散射仪对制备的rhEGF-PLGA纳米粒进行表征，制备的rhEGF-PLGA纳米粒的平均粒径为259.4±2.9nm。在pH7.4 PBS缓冲液中对rhEGF-PLGA纳米粒进行体外释药考察，发现该纳米粒具有缓释效应，其在1h内突释量约为44.04％，24h累积释药量约为97.09％。
　　其次，我们利用平行制备的rhEGF-PLGA荧光纳米粒进行了体外纳米粒透皮效果的考察。实验表明，制备得到的rhEGF-PLGA荧光纳米粒具有与rhEGF-PLGA纳米粒相似的粒径和药物释放特征。将裸鼠皮肤分为完整皮肤组和去角质皮肤组，在透皮扩散池中进行纳米粒透皮实验，利用荧光显微镜观察荧光纳米粒在皮肤中的分布，发现rhEG-PLGA荧光纳米粒可有效透过皮肤角质层，进入皮肤真皮层，并且在去角质皮肤组中的荧光强度明显大于完整皮肤中的荧光强度，说明在角质层受损时，rhEGF-PLGA纳米粒的透皮量大大增加。这个现象提示了在皮肤溃疡或外伤等皮肤角质层遭到破坏的情况下，rhEGF-PLGA纳米粒可更有效的携带药物进入活性表皮层，发挥表皮生长因子的生物活性，更好的促进皮肤溃疡或外伤的愈合。此外，实验中我们也观察到，无论是在完整皮肤还是在去角质层的皮肤中，毛囊均可作为rhEGF-PLGA荧光纳米粒进入活性表皮层的有效通道。
　　第三，细胞划痕实验和CCK8细胞增殖实验的结果，证明了所制备的rhEGF-PLGA纳米粒仍然具有较好的EGF生物学活性，实验均以对EGF敏感的小鼠成纤维细胞Balb/C3T3细胞为对象。在划痕实验中观察到rhEGF-PLGA纳米粒可有效的促进Balb/C3T3细胞的生长，其促进3T3细胞生长的能力与同浓度的rhEGF溶液相当，且随着rhEGF-PLGA纳米粒浓度的加大而增强。CCK8细胞增殖能实验的结果也表明rhEGF-PLGA纳米粒具有良好的促Balb/C3T3细胞增殖的生物活性，且随着给药剂量的增大，rhEGF-PLGA纳米粒促进Balb/C3T3细胞增殖的能力随之增强。有意思的是，在细胞增殖试验中我们发现，随着时间的推移，rhEGF溶液促进Balb/C3T3细胞增殖的能力逐渐减弱，而rhEGF-PLGA纳米粒促进Balb/C3T3细胞增殖的能力却逐渐增强，证明了rhEGF-PLGA纳米粒具有缓释效果，可有效延长药物的作用时间。
　　最后，我们分别构建了家兔外伤模型和糖尿病大鼠皮肤溃疡模型，并利用这两种动物模型在体内验证了rhEGF-PLGA纳米粒经皮给药对外伤和糖尿病皮肤溃疡的治疗效果。实验结果表明，与生理盐水和PLGA空白纳米粒相比，rhEGF-PLGA纳米粒可加快受损部位皮肤的生长，有效促进外伤和糖尿病溃疡皮肤的愈合，病理切片检查结果表明新长出的皮肤结构致密、完整，愈合效果显著优于空白对照组，证明了rhEGF-PLGA纳米粒经皮给药对外伤和糖尿病溃疡皮肤的愈合均具有良好的治疗效果。
　　综上所述，本研究采用了W/O/W复乳化溶剂挥发法制备得到了rhEGF-PLGA纳米粒，通过工艺优化，提高了纳米粒的包封率，获得了制备工艺简单，重现性好的rhEGF-PLGA纳米粒的制备方法。rhEGF-PLGA纳米粒透皮实验证明该纳米粒可以有效的透过角质层，达到真皮层，在角质层受损的情况下透皮效果更好。通过细胞划痕实验和CCK8细胞增殖实验，证明了rhEGF-PLGA纳米粒可以有效促进Balb/C3T3成纤维细胞的增殖，具有良好的生物学活性并具有缓释作用。通过构建的家兔外伤模型和糖尿病大鼠皮肤溃疡模型动物实验证明了rhEGF-PLGA纳米粒可以有效的促进皮肤伤口的愈合，对外伤和糖尿病性皮肤溃疡具有良好的治疗作用，为rhEGF-PLGA纳米粒新型经皮给药体系的应用提供了理论基础。

目录

声明

摘要

前言

第一章 rhEGF-PLGA纳米粒的制备、处方优化及表征

1．仪器与器材

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

2．实验方法

2．1 rhEGF-PLGA纳米粒的制备、处方优化及表征

2．2 rhEGF-PLGA纳米粒体外释药的考察

3 结果

3．1 BSA蛋白标准曲线的绘制

3．2 rhEGF-PLGA纳米粒包封率与载药量的测定结果

3．3 正交实验的结果

3．4 rhEGF-PLGA纳米粒提取回收率实验结果

3．5 rhEGF-PLGA纳米粒的粒径分布图

3．6 rhEGF纳米粒形态的透射电镜观察结果

3．7 rhEGF-PLGA纳米粒体外释药的考察结果

4 讨论

5 小结

第二章 rhEGF-PLGA纳米粒透皮效果的研究

1．仪器与器材

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2 实验方法

2．1 离体皮肤的制备及预处理

2．2 rhEGF-PLGA荧光纳米粒的制备及表征

2．3 rhEGF-PLGA荧光纳米粒透皮实验

2．4 rhEGF-PLGA荧光纳米粒透皮效果的荧光显微镜观察

3 结果

3．1 rhEGF-PLGA荧光纳米粒的围片

3．2 rhEGF-PLGA荧光纳米粒的表征

3．5 rhEGF-PLGA荧光纳米粒透皮效果的荧光显微镜观察结果

4．讨论

5．小结

第三章 rhEGF-PLGA纳米粒的生物活性研究

1．仪器与器材

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2．实验方法

2．1 Balb／C 3T3细胞的培养

2．2 Balb／C 3T3细胞的划痕实验

2．3 rhEGF-PLGA纳米粒的活性测定

3．结果

3．1 Balb／C 3T3细胞划痕实验的结果

3．2 CCK8细胞增殖实验结果

4 讨论

5 小结

第四章 rhEGF-PLGA纳米粒经皮给药的体内药效研究

1．仪器与器材

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2．实验方法

2．1 家兔皮肤外伤模型

2．2 糖尿病大鼠皮肤溃疡模型

3．结果

3．1 家兔皮肤创面愈合的结果

3．2 糖尿捕大鼠伤口愈合的结果

4．讨论

5．小结

全文总结

参考文献

致谢

文献综述 PLGA应用的研究进展

作者简历