载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒及其制备方法，该纳米粒的重量百分比组成为：重组人血管内皮抑制素1％～9.8％，PEG-PLGA 90.2％-99％；该纳米粒粒径在50～500nm，多分散指数为0.28～1。本发明得到的纳米粒表面较光滑圆滑，无粘连，纳米粒大小可控，粒径小、范围窄，便于静脉注射，缓释效果好；PEG修饰后的载体材料包封药物效果好，并且其亲水性可以发挥避免内皮网状系统捕获的长循环的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用高分子材料载药纳米粒及其制备方法。

背景技术

20世纪70年代，美国哈佛大学Folkman教授就提出实体瘤及其转移灶生长至1～2mm以上时，可以通过阻断肿瘤新生血管生成来达到抑制和治疗肿瘤的目的。血管内皮抑制素(endostatin)正是基于此，能特异性抑制内皮细胞的增值及血管生成，使肿瘤处于休眠状态，从而抑制肿瘤生长。它能使肿瘤血管内皮细胞的增值与凋亡重新恢复到平衡状态且无细胞毒性，抗肿瘤谱广，不产生耐药，且治疗靶向明确，有很好的临床应用前景。但由于恩度(重组人血管内皮抑制素rh-Endo)与NP化疗方案联合给药时，在治疗周期的第1～14日需要每日给药，给药次数比较频繁，增加患者的痛苦，降低了患者的依从性。因此，研究能长期缓释且保持其生物活性的缓释系统具有重要意义。

纳米控释系统由于其可以静脉注射，延长保留时间的效应(EPR)被动靶向，透过生物屏障及缓释等诸多优点，渐渐被用来包裹化疗药物。利用纳米缓释载体制备成缓释系统后，不仅能达到延长药物在体内的作用时间，降低给药频率，而且可以维持有效地血药浓度，提高治疗效果。一般可生物降解的聚合物纳米粒载体材料包括天然和合成两类。PLGA作为无毒性、可降解的合成高分子材料，具有良好的生物相容性。但由于该纳米粒表面具有一定的疏水性，其纳米粒静注后易被巨噬细胞识别、包围、吞噬，使该纳米粒在血液循环系统中的循环时间减少，降低疗效。目前还没有一种合成聚合物纳米粒载体材料可用于血管内注射的临床报道。其最根本原因之一是载体材料与血细胞长期接触的血液不相容性。

日本今井庸二提出，具有血液相容性材料应在0.1～0.2um范围内具有物理或化学上的不均匀微观结构。同时很多实验结果显示，当聚合物呈现某种特定的相分离结构时，表现出良好的血液相容性。因此，在一个大分子链上同时含有亲水和疏水链段的两亲(或两性)嵌段及接枝共聚物如：聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA上接枝聚乙二醇PEG引起了人们的注意。PEG同样没有毒性，无免疫原性，并且可生物降解，其降解产物易于从体内排出而不蓄积。把PEG接枝在PLGA形成二嵌段共聚物，这类含有不相容链段的共聚物具有微观相分离的形态。动物实验结果表明：与静脉PLGA纳米粒相比，静注PEG-PLGA纳米粒后，纳米粒中的药物在血液循环中的滞留时间明显延长。尽管这样，当前研究载活性蛋白的还是微球的较多，有研究载恩度(重组人血管内皮抑制素)缓释微米球的，如专利CN101536984A，CN101428142A；该类缓释微球只能皮下或腹腔注射，不能用于静脉注射。微球的粒径远大于纳米粒，静脉注射易导致栓塞，后果严重；并且微球释放的药物需要经过组织扩散，透过血管内皮屏障后方能进入血液循环到肿瘤生长部位，起效药物量较少，不能很好的发挥药物的治疗作用。由于恩度(重组人血管内皮抑制素)是刚上市的蛋白类新药，且蛋白质药物分子量较大(22KDa)，难以包裹在纳米粒载体中，所以关于载恩度PEG-PLGA纳米粒的研究甚少。专利CN1608675A公开了一种高分子材料载药纳米粒，该种纳米粒采用PELGE和PELGA三嵌段共聚物为载体，载体材料分子量大，其涉及包裹的内容主要是基因，涉及小分子多肽类药物胸腺五肽，没有对大分子蛋白类化疗药物进行技术公示；而且制备出纳米级的微粒粒径分布较宽、载药量少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒及其制备方法。

本发明采取的技术方案为：

载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA(聚乙二醇-聚乙丙交酯)纳米粒，该纳米粒的重量百分比组成为：重组人血管内皮抑制素1％～9.8％，PEG-PLGA 90.2％-99％；该纳米粒粒径在50～500nm，多分散指数(PDI)为0.28～1。

上述载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒最佳粒径在100～300nm。

本发明用的载体材料PEG-PLGA(购于山东省医疗器械研究所)是用丙交酯/乙交酯(LA/GA)为50∶50分子量为45KDa的聚乙丙交酯(PLGA，Poly(DL-lactide-co-glycolide))和纯度为95％的2KDa的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)聚合成，PEG含量10％，其有机溶剂为二氯甲烷(DCM)，其有机溶剂残余量低于限量的1/10，粒径在50～500nm。

上述载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将一定量的PEG-PLGA加到一定体积的二氯甲烷(DCM)有机溶剂中构成有机相，取适量的恩度水溶液作为水相，将恩度水溶液加入有机相中2000～2800rpm涡旋混合，其匀化后形成初乳(w₁/o)；

(2)将形成的初乳加到由一定量的乳化剂和去离子水所构成的乳化剂水溶液中，高速20000～25000rpm搅拌再次乳化均匀，继而在室温条件下搅拌蒸发有机溶剂2～8小时，使二氯甲烷挥发完全，即得PEG-PLGA纳米粒的胶体溶液(w₁/o/w₂)，经洗涤干燥得纳米粒。

所述的载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒的制备方法，步骤(1)中所述的PEG-PLGA与恩度的重量比例为9～40∶1；所述的有机溶剂与恩度水溶液的体积比例为1∶5～20。

上述步骤(1)中所述的恩度水溶液浓度为5mg/ml～15mg/ml。

上述步骤(2)中所述的初乳与乳化剂水溶液的体积比例为1∶4～10。

步骤(2)中所述的乳化剂水溶液为0.1％～0.5％(wt％)的PVA溶液。

本发明的有益效果：

第一、恩度是是大分子蛋白质类药物，本发明的上述方法可以应用于载化学药物或多肽、蛋白药物的PEG-PLGA纳米粒的制备。

第二、本发明制备的载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒，表面较光滑圆滑，无粘连，粒径小，粒径在50～500nm，最佳粒径在100～300nm，粒径分布窄，不仅可以同微球一样肌肉注射，还适合静脉注射，能更有效得到达肿瘤生长部位；

第三、使用PEG-PLGA作为载体材料，包封率高，在50～98％，使得转载药物的能力增强，载药量高；

第四、缓释效果好，w₁/o/w₂的纳米粒在体外条件下缓释时间在1月以上；不同于w/o/o纳米粒，PEG亲水基团可以有效得避免内皮网状系统的捕获，体内循环系统中的滞留时间明显延长，能稳定的释放药物；

第五、制备方法简单、适宜大规模连续生产。

第六、该方法得到的纳米粒能缓慢的释放药物，更有利于恩度发挥其抗癌药效。

附图说明

图1载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒粒径分布图。

图2载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒透射电镜图。

图3载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒透射电镜图。

图4载重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒体外释放曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明加以进一步的说明。

实施例1：

精确称取PEG-PLGA 5mg，加到1ml二氯甲烷中溶解构成有机相。取50ul的浓度为10mg/ml的恩度水溶液作为水相。将恩度溶液加入有机相中2800rpm涡旋混合，其匀化后形成初乳。称取聚乙烯醇(PVA)加入双蒸水中使其充分溶解，调节使其浓度为0.1％，构成外水相。内水相与外水相的体积比为1∶4。将制备的初乳立即加到外水相中，25000rpm高速剪切60s，将所得乳液倒入10ml 0.1％聚乙烯醇溶液中，用磁力搅拌蒸发有机溶剂4～5小时，使二氯甲烷挥发完全，即得PEG-PLGA纳米粒的胶体溶液。平均粒径为109nm，包封率为89.3％，如图3。

实施例2

精确称取PEG-PLGA 10mg，加到1ml二氯甲烷中溶解构成有机相。取50ul的浓度为10mg/ml的恩度水溶液作为水相。将恩度溶液加入有机相中2800rpm涡旋混合，其匀化后形成初乳。称取聚乙烯醇(PVA)加入双蒸水中使其充分溶解，调节使其浓度为0.25％，构成外水相。内水相与外水相的体积比为1∶4。将制备的初乳立即加到外水相中，20000rpm高速剪切60s，将所得乳液倒入10ml 0.25％聚乙烯醇溶液中，用磁力搅拌蒸发有机溶剂4～5小时，使二氯甲烷挥发完全，即得PEG-PLGA纳米粒的胶体溶液。平均粒径为198nm，包封率为94.9％，如图2。

实施例3

精确称取PEG-PLGA18mg，加到1ml二氯甲烷中溶解构成有机相。取200ul的浓度为10mg/ml的恩度水溶液作为水相。将恩度溶液加入有机相中2000rpm涡旋混合，其匀化后形成初乳。称取聚乙烯醇(PVA)加入双蒸水中使其充分溶解，调节使其浓度为0.25％，构成外水相。内水相与外水相的体积比为1∶4。将制备的初乳立即加到外水相中，20000rpm高速剪切60s，将所得乳液倒入10ml 0.25％聚乙烯醇溶液中，用磁力搅拌蒸发有机溶剂4～5小时，使二氯甲烷挥发完全，即得PEG-PLGA纳米粒的胶体溶液。平均粒径为253nm，包封率为98％。

实施例4

参数及性能测试：

纳米粒的粒度用激光粒度仪和透射电镜测量所得。

纳米粒中DNA的包封率的测定：

取载恩度PEG-PLGA纳米粒胶体溶液，在40000r/min条件下离心40min，取上清液1ml，用Bradford法，根据标准曲线计算上清液中恩度的浓度，按下式计算包封率：

包封率(％)＝[(X₁-X₂)/X₁]×100％

式中X₁为未经包封前恩度的总浓度，X₂为上清液中恩度的浓度。

纳米粒体外释放实验：

采用动态渗析法，将定量的纳米粒胶体置于透析管内，加释放介质pH7.4磷酸盐缓冲液封口，置于(37±0.5)℃条件下恒温搅拌，转速为70r/min，定时离心测上清液浓度。弃上清液用缓冲液洗涤3次后并补充相同体积释放介质。样品液按Bradford法测样品液中恩度浓度，并计算累计降解百分率。

实施例1、2、3得到粒径在50～500nm，表面较光滑圆滑，无粘连的重组人血管内皮抑制素的PEG-PLGA纳米粒，纳米粒大小可控，粒径范围窄(如附图1)，便于静脉注射；PEG修饰后的载体材料包封药物效果好，并且其亲水性可以发挥避免内皮网状系统捕获的长循环的作用。纳米粒缓释效果好，体外释放时间长，能达到1个月以上。如附图4释放分为前半部分的突释期和后半部分的稳定期，释放量稳定。