热带假丝酵母pxa1基因敲除及对长链二元酸产量的影响

摘要

长链二元酸（Long chain dicarboxylic acid，DCA）是精细化工中有着重要作用的一类中间体。热带假丝酵母（Candida tropicalis）通过微生物发酵法氧化烷烃和脂肪酸产生DCA，但合成DCA代谢途径中过度的β-氧化会造成DCA的产量下降。Pxa1p为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）过氧化物酶体上的转运蛋白，能够特异的负责转运长链脂肪酸进入过氧化物酶体中，进行β-氧化。本研究通过基因工程手段比对分析找到C.tropicalis的转运蛋白Pxa1p，并敲除了对应的基因pxa1，探索阻碍部分长链脂肪酸进入过氧化物酶体，减少长链脂肪酸的消耗的新路线。 (1)以C.tropicalis1798作为出发菌种，根据单交换原理，通过重叠PCR方法直接构建了敲除片段pxa1p-kanr，运用电转化法进行同源片段重组，构建了pxa1基因单拷贝缺失菌株C.tropicalis1798-pxa1，并通过抗生素G418抗性、PCR筛选等实验，证实了pxa1基因单拷贝缺失菌C.tropicalis1798-pxa1构建成功。经过发酵验证，单拷贝缺失菌C.tropicalis1798-pxa1较原始菌株C.tropicalis1798十二碳二元酸的产量提高了56.1％，产出浓度为6.4 g/L。由此推测pxa1基因的敲除，阻断或减少了部分长链脂肪酸进入过氧化物酶体中，减弱了β-氧化反应与DCA的消耗，提高了DCA的产量。 （2）利用PCR技术扩增获得C.tropicalis同源臂pxa1p2，经酶切连接到带有潮霉素抗性基因hph的质粒pFA6a-hphMX-tetO-Pcyc1-3xFLAG上，运用电转化法进行同源片段重组，构建了pxa1基因双拷贝缺失菌C.tropicalis1798-pxa1p2，并通过抗生素潮霉素 B抗性、PCR筛选等实验，证实了 pxa1基因双拷贝缺失菌C.tropicalis1798-pxa1p2构建成功。摇瓶实验表明双拷贝缺失菌 C.tropicalis1798-pxa1p2十二碳二元酸产量较原始菌株C.tropicalis1798十二碳二元酸产量下降，产量为2.3 g/L。初步推测是由于pxa1基因的完全敲除，影响了菌体的正常代谢，导致产酸水平比较低。 （3）对目的重组菌C.tropicalis1798-pxa1合成DCA的发酵条件和培养基组分进行了优化。利用PB法实验、单因素实验和正交实验研究摇瓶发酵培养基组分对十二碳二元酸产量的影响，确定了最优的培养基：葡萄糖30g/L，酵母浸粉1 g/L，(NH4)2SO41 g/L，VB10.2 g/L，NaCl2 g/L，KH2PO48 g/L，Na2HPO4·12H2O10.08 g/L，尿素1.5 g/L，Mg2SO4·7H2O6.15 g/L。确定了发酵十二碳二元酸的最适温度为30℃，菌体最适生长pH为5.0，发酵十二碳二元酸的最适pH为7.5。用上述优化的发酵培养基进行摇瓶实验，十二碳二元酸的产量为8.3 g/L，提高了29.7%。 本论文通过对 C.tropicalis代谢途径进行遗传改造，初步探究了长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p在C.tropicalis中与DCA的消耗关系，探究了阻碍部分长链脂肪酸进入C.tropicalis过氧化物酶体，减少长链脂肪酸的消耗的新路线。构建了C.tropicalis pxa1基因单拷贝缺失菌株 C. tropicalis1798-pxa1和双拷贝缺失菌株 C.tropicalis1798-pxa1p2，提高了十二碳二元酸的产量。