大肠杆菌二氢叶酸还原酶的基因克隆、重组蛋白纯化及蛋白质分子间的交联

摘要

蛋白质分子间异肽键交联是生物体内普遍存在的一种蛋白质分子间交联形式.目前对它的研究主要集中在对谷氨酰胺转移酶和泛素-蛋白水解酶复合体途径的研究两个方面.我们以溶菌酶、核糖核酸酶A和蛋白质二硫键异构酶为模型对异肽键进行了体外详细的研究,提出了解释异肽键形成机理的假说:1)蛋白质发生构象变化包括二级结构的改变;2)蛋白质形成分子间二硫键;3)二硫键的形成帮助蛋白质形成了分子间异肽键.利用PCR技术从大肠杆菌DH<,5α>中获取二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(folA).用限制性内切酶BamHI与Pst I将该片段插入到克隆载体pUC18上,DNA测序鉴定目的基因.而后再将该基因亚克隆到表达载体pTrcHisC上,IPTG诱导表达重组蛋白.在非变性条件下,用TALON金属亲和层析树脂纯化含组氨酸标记的重组DHFR蛋白.纯化产物在热诱导条件下,SDS-PAGE分析,除23 kDa单体外,还出现了交联的二聚体和多聚体,而当反应体系中含有还原剂DTT时,二聚体和多聚体都消失.因此推断蛋白质在热诱导条件下二级结构发生改变而产生交联,并且有二硫键的参与.为了进一步验证上述理论,利用PCR定点突变技术,以质粒pTrcHisC-DHFR上的野生型DHFR DNA为模板,获取突变型(Cys 85/152 Ser)二氢叶酸还原酶基因.而后再将突变型基因克隆到表达载体pTrcHisC上,表达纯化突变型DHFR.而在与野生型相同的热诱导条件下,突变型DHFR蛋白质中完全没有形成二聚体/多聚体,这说明二硫键对蛋白质的交联起着至关重要的作用.将DHFR和lysozyme两种蛋白质的混合物进行热变性交联实验,结果显示,在同源和异源肽链间都有二聚体和多聚体形成.

目录

摘要

ABSTRACT

缩略表

第一章综述

1.1蛋白质交联研究进展

1.1.1和蛋白质交联相关的一些生理过程

1.1.2蛋白质交联与许多疾病的形成相关

1.1.3蛋白质交联机理

1.2协助蛋白质折叠的生物大分子

1.2.1分子伴侣

1.2.2折叠酶

1.3固定化金属螯合亲和层析技术

1.3.1基本原理及应用

1.3.2纯化重组蛋白

1.4二氢叶酸还原酶简介及本文研究目的

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.2.1 PCR方法合成二氢叶酸还原酶基因

2.2.2 PCR定点突变技术合成突变型二氢叶酸还原酶基因

2.2.3二氢叶酸还原酶基因的克隆

2.2.4 IPTG诱导表达及DHFR的纯化

2.2.5蛋白质浓度测定

2.2.6热诱导去折叠(thermal unfolding)

2.2.7蛋白质印迹(Western Blot)

第三章结果与分析

3.1 PCR法合成二氢叶酸还原酶基因及PCR定点突变法合成突变型二氢叶酸还原酶基因

3.2重组质粒的酶切鉴定及筛选克隆DHFR基因

3.3 IPTG诱导表达及DHFR纯化

3.4重组蛋白的热诱导去折叠反应

3.4.1野生型DHFR的体外交联

3.4.2 Cys突变为Ser影响蛋白质分子间交联

3.4.3异源蛋白质分子间的交联

第四章讨论与展望

4.1讨论

4.1.1 DHFR热诱导去折叠结果讨论

4.1.2蛋白质热诱导去折叠过程中应注意的几个问题

4.1.3定点突变

4.1.4 TALON金属亲和层析法纯化DHFR

4.2展望

第五章小结

参考文献

附图

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢