溶菌酶和重组大肠杆菌蛋白质体外分子交联的初步研究

摘要

蛋白质分子间交联在生物体内与许多重要的正常生理过程密切相关.通过对核糖核酸酶A、溶菌酶和蛋白质二硫键异构酶(PDI)的氧化再折叠研究,高音等人首次发现在此过程中有二聚体或多聚体产生,同时使用蛋白质化学研究方法对蛋白质分子交联的化学本质进行探讨,鉴定出交联的化学键有二硫键和异肽键,并且实验证实阻断分子间二硫键的形成就能防止分子间异肽键的形成;与再折叠相反的去折叠实验也得到同样的结论.由此,我们提出蛋白质分子交联机理的三步假说:1)蛋白质构象包括二级结构的改变,2)形成分子间二硫键,3)分子间异肽键的形成.实验结果显示分子间二硫键的形成对分子间异肽键的形成起到极为有效的促进作用,且证实除了相同的蛋白质分子能交联,不同的蛋白质也可以交联.为了完善和补充蛋白质分子间交联三步假说,本实验首次以原核生物的硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)、核糖核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)和溶菌酶(Lysozyme)作为实验材料.把PCR方法克隆的大肠杆菌硫氧还蛋白(TRX)基因和核糖核酸酶HⅡ(RNase HⅡ)基因插入表达质粒pTrcHisC,构建重组蛋白质表达体系;通过IPTG诱导表达,应用TALON固定化金属亲和层析树脂纯化出重组TRX和RNase HⅡ,将它们和溶菌酶通过热诱导去折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验;结果显示,蛋白质在其临界温度反应时,出现交联二聚化和多聚化现象;这些蛋白质分子间交联包括分子间二硫键和其他共价键(异肽键);在去折叠反应体系中加入还原剂二硫苏糖醇(DTT)后,不但没有分子间二硫键交联形成,同时也没有分子间其他共价键(异肽键)交联的形成.另外,半胱氨酸残基定点突变后的RNase HⅡ 334C/S重组蛋白质,无法形成分子间二硫键,实验证实经过热诱导去折叠后也没有分子间其他共价键(异肽键)交联.这些结果进一步证明蛋白质分子间二硫键的形成能够促进蛋白质分子间其他共价键(异肽键)的形成.

目录

文摘

英文文摘

缩略表

第一章引言

1.1研究课题目的和意义

1.2论文各部分的主要内容

第二章综述

2.1蛋白质交联(Protein Cross-linking)概述

2.2蛋白质交联机制

2.3蛋白质折叠(Protein folding)概述

2.4蛋白质折叠中的辅助蛋白

2.5实验模型的相关资料

第三章材料和方法

3.1材料

3.2方法

3.2.1 PCR引物设计及目的基因的合成

3.2.2重组质粒的构建

3.2.3重组蛋白的诱导表达

3.2.4目的蛋白的纯化

3.2.5热诱导去折叠(Thermal unfolding)实验

3.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.7蛋白质印迹

第四章 结果与分析

4.1目的基因的序列分析

4.2重组质粒鉴定

4.3重组蛋白的诱导表达

4.4目的蛋白的纯化

4.5温度影响蛋白质分子间交联

4.6异源蛋白分子间二硫键的形成

4.7链间二硫键促进链间其他共价键（异肽键）交联

4.8定点突变破坏分子间交联

4.9蛋白质印迹检测

第五章讨论

小结

参考文献

附图

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文