鸡源志贺菌IpaC基因的克隆及原核表达

摘要

本研究对鸡源志贺菌IpaC基因进行了克隆、重组表达与鉴定及蛋白纯化。首先，应用PCR方法从志贺菌毒力大质粒中扩增出大小为1092 bp的目的基因，与国内外发表的10株人源志贺菌IpaC序列进行同源性分析，结果表明鸡源志贺菌IpaC基因与参考菌株的核苷酸序列同源性为97．3％-99．8％、氨基酸序列同源性为96．4％-99．7％。进化树结果显示，与参考株AL391753相似性较大，它们在同一个分支上。然后，将该基因克隆至载体pET32a(+)中，构建了原核表达载体pET32a(+)-IpaC，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达并进行表达条件的优化。SDS—PAGE电泳结果显示：在相对分子量约63 kDa处出现条带，而对照组无目的条带产生。最佳表达条件确定为诱导前培养3 h、IPTG终浓度为1．0mmol／L、加入IPTG诱导4 h。最后，大量表达目的蛋白并裂解细菌进行可溶性鉴定，结果蛋白既存在上清中也存在包涵体中。上清蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后纯度可达90％以上。Western Blot分析显示，重组蛋白与ZMD-01株阳性血清发生特异性反应，证明表达产物具有艮好的反应原性。