鸡源志贺菌的分离鉴定、IpaC基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

摘要

志贺菌是人类感染性腹泻的主要病原体之一，也可感染人以外的灵长类动物。以往人们认为志贺菌不感染畜禽，事实上，国内外大量的资料表明志贺菌可感染猪、牛、兔、鸭、鸡等畜禽，并可引起它们发病甚至死亡。鸡志贺菌病是近些年发现的急性传染病。该病流行广泛，危害严重，可引起不同品种、不同日龄的鸡发生腹泻，并可导致雏鸡死亡，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。又因志贺菌可能在人禽间造成交互感染，这就给人类公共卫生安全造成了严重隐患。因此，对鸡志贺菌病展开研究不但具有重要的兽医卫生学意义，而且具有重大的医学公共卫生学意义。
　　 本研究以采集的腹泻鸡病料为材料进行志贺菌的分离，之后克隆、分析鸡源志贺菌IpaC基因，最后原核表达IpaC蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。具体研究结果如下：
　　 1.通过分离培养、抹片镜检、生化试验、PCR试验及动物试验对腹泻鸡病料进行志贺菌的分离鉴定。结果显示：从驻马店腹泻鸡心血中分离出1株志贺菌；该菌致病性较强，攻毒组雏鸡发病率为100％(10/10)、病死率为50％(5/10)，临床表现为病鸡拉血便，重者脓血痢；病(死)鸡剖检可见肠壁变薄、有出血斑，肝脏肿大出血，肺出血、淤血，脾脏出血，肾肿大；镜检可见肠道、肝脏、脾脏、肺脏有明显病变，具体表现为肠粘膜上皮细胞坏死脱落，肠绒毛结构崩解，固有层出血，肠腺萎缩，肝脏中央静脉及窦状隙扩张淤血，脾窦淤血，肺泡、支气管、呼吸性支气管淤血。
　　 2.根据GenBank上发表的人源志贺菌IpaC基因ORF两端的保守区设计一对引物，用PCR方法从ZMD-01株鸡源志贺菌毒力质粒上扩增出IpaC基因片段并成功克隆到pMD18-T载体后进行测序。测序结果表明：与人源志贺菌相比，发现仅存在2个碱基突变，757位T变为C，936位G变为A，757位的突变使精氨酸变为甘氨酸，对蛋白的表达没有太大的影响；志贺菌不同分离株的IpaC基因的同源性很高，核苷酸序列同源性在97.3％-99.9％之间，其推导的氨基酸序列的同源性在96.2％-99.7％之间，其中，鸡源志贺菌IpaC基因与日本株福氏志贺菌X15319的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性最高，同源性分别为99.8％、99.7％，与美国株鲍氏志贺菌CP001062的核苷酸序列的同源性最低，为97.3％，与美国株鲍氏志贺菌CP001062和澳大利亚株痢疾志贺菌AY206439IpaC基因推导的氨基酸序列的同源性最低，为96.4％；分离株ZMD-01株鸡源志贺菌与参考株AL391753相似性较大，它们在同一个分支上。
　　 3.将ZMD-01株志贺菌IpaC基因克隆至载体pET32a(+)中，构建了原核表达载体pET32a(+)-IpaC。然后将重组表达质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，以IPTG作为诱导剂进行诱导表达，SDS-PAGE试验结果表明成功表达IpaC重组蛋白。该重组蛋白分子量约为63kDa，经薄层凝胶光密度扫描分析，目的蛋白占菌体总蛋白的21％。对诱导前菌液培养时间、IPTG浓度、诱导时间这三个条件进行优化，最终确定最佳培养条件：将含重组表达质粒pET32a-IpaC的BL21(DE3)菌液培养3h(OD值约为0.6)加入终浓度为1.0mM的IPTG，诱导4h时目的蛋白的量最大。大量表达目的蛋白后裂解细菌，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE，结果显示目的蛋白既存在于上清中，也存在包涵体中。上清液直接经Ni-AgaroseHis标签纯化试剂盒纯化后纯度可达90％以上。WesternBlot分析显示，重组蛋白与ZMD-01株阳性血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白免疫公鸡，血清最高效价可达1:12800，说明该蛋白具有良好的免疫原性。