EIAV标记感染性克隆分子的构建

摘要

本研究应用已构建好的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆裁体(pOK8266)为模板,通过SOE PCR方法在感染性分子克隆载体的S2基因独特区内引入突变点,形成含有酶切位点(NspV)的突变体(P1P4)。将突变体(P1P4)亚克隆至pBlueseript SK(M13-)质粒,形成pB-P1P4中间载体；人工合成两条六个组氨酸的引物,作为标签,将其插入pB-P1P4中间载体的NspV位点,形成带标签的中间载体；用ApaI酶切poK8266和中间载体,连接转化,构建带标签的重组感染性分子病毒克隆载体(EIAV-p8.2-HIS),经PCR、酶切和测序表明,六个组氨酸已插入pOK8266的s2基因内。分别转染驴皮肤细胞(FDD)和驴白细胞,将转染驴皮肤细胞收获物传至第六代,电镜下未观察到EIAV病毒；而将转染驴白细胞收获物传代至第六代时,电镜下观察到了典型的病毒粒子。提取前病毒DNA,PCR扩增P1P4片段,亚克隆至pMD18-T载体,测序证明前病毒DNA含有六个组氨酸,从而在体外获得了感染性克隆病毒株。本研究通过SOE法巧妙地对S2基因引入突变,插入HIS标签,成功地获得了标记感染性分子克隆,证明S2基因缺失突变株在体外巨嗜细胞上培养不影响其复制力,为野毒株和疫苗毒的鉴别诊断打下基础。