Apelin的生物信息学特征分析和PI3K-自噬途径介导apelin-13促进心肌细胞IL-8分泌机理研究

摘要

目的:探讨多肽apelin的基本性质分析及与趋化因子之间的相互作用,并探讨apelin-13对心肌细胞分泌IL-8的影响和其PI3K-自噬调节机制.方法:采用ProtParam、expasy、BioEdit、TMHMM2.0、TMpred、SignalP3.0 Server、COIL Server、TargetP1.1 Server、SMART、PROSITE、Predictprotein、PRIPRED、SSPro服务器、Swiss-Model服务器、Phyre等在线分析工具和软件,分析和预测apelin的基本性质及与相关蛋白之间的相互作用,培养大鼠H9c2心肌细胞系,western blot方法检测PI3K等信号转导蛋白和LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、beclin 1等自噬相关蛋白的表达;ELISA试剂盒检测心肌细胞培养上清液中IL-8的含量.结果:生物信息学软件分析显示apelin由77个氨基酸组成，亮氨酸(Leu:16.9%)，甘氨酸(Gly:14.3%)和精氨酸(Arg:13.0%)的含量最高;9-14位氨基酸含有一个明显的疏水性区域;7-29位氨基酸存在一个跨膜螺旋区域;23和24位最有可能为信号肤的剪切位点;33-38位含有1个豆范酞化位点;57-60含有1个酞胺化位点和70-72位含有1个蛋白激酶磷酸化位点。二级结构中a-螺旋结构所占比例最高为27.27%，β-折叠结构最少，无蜷曲螺旋结构。亚细胞定位apelin的分泌途径定位到细胞周质;SMART分析发现了九个与apelin相互作用的蛋白质，分别是INS,NPY,GAL,PDYN,PNOC,CCRS,NPB,OPRM 1,CCL28;western blot方法检测结果显示:apelin-13(0.01μM)处理H9c2大鼠心肌细胞1小时后，促进细胞PI3K,Akt的磷酸化和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，beclin 1的表达;PI3K抑制剂LY294002(25μM)和Akt抑制剂1701-1(10μM)均抑制apelin-13诱导的心肌细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，beclin 1的表达。ELISA试剂盒检测结果发现apelin-13(0.01μM)处理细胞6小时后，可以促进心肌细胞分泌IL-8，干扰APJ后，能够抑制apelin-13诱导的心肌细胞分泌IL-8;PI3K抑制剂LY294002(25μM),Akt抑制剂1701-1(10μM)和自噬抑制剂3MA(5mM)均阻断apelin-13诱导的心肌细胞分泌IL-8.结论:Apelin是一个具有明显疏水性区域的跨膜蛋白，能够与一些趋化因子如CCRS和CCL28发生相互作用，且可以通过PI3K-自噬途径促进心肌细胞分泌趋化因子IL-8。