门静脉注射小鼠Hepcidin基因特异性RNAi腺病毒的方法研究

摘要

目的：门静脉注射小鼠hepcidin基因特异性小发夹RNA(shRNA)重组腺病毒干扰载体,观察其对肝脏hepcidin mRNA的干扰效果.方法：根据genbank小鼠hepcidin基因序列及相关文献,设计shRNA并合成1对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至线性化pENTR/U6入门载体,以CMV-EGFP改造载体,利用Invitrogen公司LR重组系统与pAd/BLOCK-IT-DEST进行重组,构建pAD-U6-shRNA-CMV-EGFP腺病毒载体,转染293A细胞进行包装、扩增,获得腺病毒.实验组用balb/c小鼠麻醉后行病毒门静脉注射,常规饲养10d后取成活小鼠肝组织,Trizol法提取RNA,半定量PT-PCR法检测mRNA表达.另检测正常小鼠肝脏mRNA表达作对照.结果：经测序鉴定证实pAD-U6-shRNA-CMV-EGFP腺病毒载体构建成功，获得病毒的滴度为:2.7X 109ifu/ml。实验组hepcidin基因表达为1.30士0.53，明显低于对照组(<6.39±1.00).结论：成果构建小鼠hepcidin基因特异性小发夹RNA(shRNA)重组腺病毒干扰载体，其门静脉注射能够有效抑制目的基因表达。