产丙酮酸酿酒酵母的进化代谢工程改造

摘要

丙酮酸(Pyruvic acid),又称2-氧代丙酸(2-oxopropanoicacid)、α-酮基丙酸,是最重要的有机酸之一,广泛应用于生物制药、农用药品、食品工业、生化研究、传感器及医用等领域.丙酮酸的合成已逐渐由生物制造法代替了传统生产工艺,丙酮酸是微生物细胞代谢的中心中间代谢产物,正常代谢过程中无法在细胞内大量积累,故微生物法合成丙酮酸首先需要构建能够大量积累丙酮酸的平台菌株;发酵过程中通过分批添加高温灭菌的固体CaCO3来调节pH值,生成的丙酮酸钙还需要进一步的分离提纯等流程来获得丙酮酸,使得丙酮酸生产、纯化成本变高,流程繁琐且耗时更长,为解决这一问题,拟通过适应性进化手段驯化筛选出能够耐受低pH值的丙酮酸高产酵母菌株.本课题的意义在于建立了丙酮酸高通量筛选方法-双酶偶联法，该方法具有高效率、低成本、高准确度的特点，避免了常规液相HPLC法检测时前期样品处理的繁琐及检测过程耗时长的缺点;构建了能够积累丙酮酸的PDC基因缺失平台菌株，可作为后续代谢工程改造丙酮酸生产菌株的出发菌;利用TALEN蛋白介导构建突变库，获得耐低pH值同时高产丙酮酸的菌株，该菌株可以减少了大规模发酵生产中控制pH值及后续丙酮酸分离纯化的繁琐工作量，为丙酮酸生物制造研究奠定了一定的基础。