肿瘤治疗性多肽疫苗——重组人纽表位肽12质控方法和标准的研究

摘要

目的:建立重组人纽表位肽12质控方法和质量标准.方法:采用FVB/N转neu基因小鼠,以COS细胞瞬时表达的erbB3胞外全长片段(分子量为80KDa,电泳纯度>95％)作为包被抗原,建立ELISA检测方法,分析给药后小鼠的抗体阳转百分率以评价其生物学活性即小鼠给药后产生抗人纽表位肽12血清抗体的效力,并通过Western blot方法验证ELISA检测的小鼠抗人纽表位肽12血清中的抗体特异性;以胃蛋白酶为蛋白水解酶,制备供试液,对水解的肽段以Waters symmetryshied RP13(3.9×150mm)为分析柱,以0.1％三氟乙酸—水—乙腈为流动相,梯度洗脱,建立了标准肽图分析法,用于重组人纽表位肽12的质量控制,并应用RP-HPLC法探索最佳酶切条件;以Aglient Zorbax GF-250(4.6×250mm)为分析柱,以8mol/L脲溶液、500mmol/L氯化钠溶液、30mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)为流动相,流速为0.35ml/min,检测波长:214nm,测定胶体溶液中的抗原含量.结果:以携带erbB2基因的FVB/N转neu基因小鼠(TgN MMTVneu 202 Mul,Jackson Lab.,USA)对样品活性进行重复测定,平均抗体阳转百分率为84％,变异系数为6.7％(n=4),该方法结果准确、客观、重复性好,可用于此制品的常规质量控制.肽图测定结果显示不同批次重组人纽表位肽12样品之间的肽图谱能很好重叠,且与重组人纽表位肽12理化对照品的肽图比较,完全吻合,同时胃蛋白酶并不干扰肽图的测定.用HPLC法测定胶体溶液中的抗原含量,其线性范围:0.5~20μg,r=0.998,回收率为100.25％,RSD为1.35％(n=9),日内精密度RSD<1.5％,日间精密度RSD<2.0％,重复性试验RSD均<1.5％(3个批号,每批三份),最低检出限为0.1μg,尽管样品为胶体溶液,本方法在含量测定时既可将胶体溶解又不影响对主成分的测定,且结果快速准确,重现性好.并在此基础上建立了重组人纽表位肽12质量标准.结论:所建立的方法和质量标准已用于重组人纽表位肽12产品的检定.