利用细菌转座子构建适用于家蚕的快速杆状病毒基因表达系统

摘要

家蚕杆状病毒基因表达系统是目前高效的真核表达系统之一,但目前的技术在重组病毒构建和纯化过程中存在着重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长的缺点.为了较好地解决这个问题,我们借鉴国外AcNPVBac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,利用细菌转座子的基因定位转移作用,在大肠杆菌内实现基因的转移重组,快速获得重组病毒,构建了可利用我国特色资源昆虫-家蚕的快速基因表达系统.具体的工作即对家蚕BmNPV基因组进行改造,通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得家蚕BmNPV病毒穿梭截体BmBacmid;并利用供体质粒上的表达金和细菌转座子,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmNPV病毒的构建.本研究的科学意义在于:在理论上它突破了家蚕BmNPV表达系统中重组病毒必须在昆虫活体或昆虫细胞内产生的思路,利用细菌转座子在细菌内构建完成家蚕BmNPV重组病毒,丰富了家蚕杆状病毒表达系统的理论;在应用上,由于它具有快速简便这一突出优点,很好地解决了家蚕杆状病毒表达系统目前存在的关键问题,具有较好的应用价值,在未来生物技术产业利用家蚕作为"生物工厂"表达生产重组蛋白及后基因组时代蛋白质结构功能分析方面,有望成为一个强有力的工具.