利用细菌转座子构建适用于家蚕的快速杆状病毒基因表达系统

摘要

家蚕杆状病毒基因表达系统是目前高效的真核表达系统之一，但目前的技术在重组病毒构建和纯化过程中存在着重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长的缺点。为了较好地解决这个问题。我们借鉴国外AcNPV Bac—to—Bac决速基因表达rn 系统工作原理，利用细菌转座子的基因定位转移作用，在大肠杆菌内实现基因的转移重组，快速获得重组病毒，构建了可利用我国特色资源昆虫一家蚕的快速基因表达系统。具体的工作即对家蚕BmNPV基因组进行改造．通过同源重组的方法，将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZ仅肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组人家蚕BmNPV基因组，替换多角体蛋白基因，获得家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacmkl；并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子，在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合，快速完成重组BmNPV病毒的构建。本研究的科学意义在于：在理论上它突破了家蚕BmNPV表达系统中重组病毒必须在昆虫活体或昆虫细胞内产生的思路，利用细菌转座子在细菌内构建完成家蚕Bm-NPV重组病毒，丰富了家蚕杆状病毒表达系统的理论；在应用上，由于它具有快速简便这一突出优点．很好地解决了家蚕杆状病毒表达系统目前存在的关键问题，具有较好的应川价值，在未来生物技术产业利用家蚕作为“生物工厂”表达生产重组蛋白及后基冈组时代蛋白质结构功能分析方面，有望成为一个强有力的工具。